李俊玉，雍艷紅，方 彪，于天月，吳蓮云，巨向紅,3*

(1.廣東海洋大學(xué)深圳研究院，廣東 深圳 518108；2.廣東海洋大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)系，廣東 湛江 524088；3.廣東海洋大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)系，廣東 湛江 524088)

熱應(yīng)激是指處于極端高溫環(huán)境中的動(dòng)物機(jī)體，表現(xiàn)出的熱喘息、免疫力下降、心力衰竭、代謝加快等非特異性生理反應(yīng)的總和。而熱應(yīng)激也已經(jīng)成為我國南方地區(qū)應(yīng)激性致病因素中危害最大的一種，給養(yǎng)殖業(yè)造成了重大的經(jīng)濟(jì)損失[1]。熱應(yīng)激豬出現(xiàn)生長緩慢、免疫力下降及對疫病的敏感性增高等現(xiàn)象[2]。本研究前期研究顯示，熱應(yīng)激能夠顯著上調(diào)豬 Toll 樣受體家族中的 TLR2、TLR4 和 TLR4選擇性剪切體的表達(dá)[3]，炎性因子 IL-2、IL-12 和IFN-γ 的表達(dá)也發(fā)生改變，出現(xiàn)嚴(yán)重的炎性因子紊亂[4]，從而激活機(jī)體的免疫系統(tǒng)。

核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域蛋白(Nucleotide binding oligomerization domain-containing protein，NOD)樣受體家族(NOD-like receptors，NLRs)屬胞漿內(nèi)模式識(shí)別受體家族[5]，參與信號傳導(dǎo)的調(diào)控，在免疫應(yīng)答過程中發(fā)揮重要作用。目前確定的哺乳動(dòng)物NLRs 有 23 種，其中 NOD1 和 NOD2 是 NLRC 亞型中最重要的 2 種胞漿受體。研究表明，NOD1/2 與配體結(jié)合后，其構(gòu)象發(fā)生變化，與下游受體作用蛋白 2 (Receptor- interacting protein 2，RIP2)相互作用使 IκB 磷酸化，從而激活核轉(zhuǎn)錄因子 NF-κB，介導(dǎo)炎癥介質(zhì)的表達(dá)[6]。NOD 還能夠作用于半胱天冬酶，介導(dǎo)細(xì)胞凋亡或相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)[7]。

作為胞漿內(nèi)模式識(shí)別受體家族的重要成員，NOD1/2 在各種病原體的感染和固有免疫過程中均起著重要的作用，是近幾年免疫學(xué)研究的熱點(diǎn)。Sengar 等研究顯示，在體外急性熱應(yīng)激牛外周血單核細(xì)胞(PBMC)和MDBK 細(xì)胞模型中檢測到NOD1/2表達(dá)上調(diào)[8]。因此，深入探究熱應(yīng)激條件下NOD 樣受體與炎性因子的表達(dá)規(guī)律，將有助于闡述其在熱應(yīng)激致病中的作用機(jī)制。鑒于此，本研究檢測了熱應(yīng)激不同時(shí)段豬 PBMC 中 NOD1、NOD2 及部分炎性因子的轉(zhuǎn)錄水平變化，為系統(tǒng)闡述NOD 樣受體在熱應(yīng)激致病中的作用機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 12 頭 2月齡(體重為 15±1 kg)的土雜豬(雷州黑豬♀×杜洛克♂)飼養(yǎng)于廣東海洋大學(xué)農(nóng)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。適應(yīng)兩周后，實(shí)驗(yàn)豬被隨機(jī)分為兩組，對照組和熱應(yīng)激組。對照組常規(guī)飼養(yǎng)，環(huán)境溫度為 20±2 ℃，相對濕度 80 %～85 %。熱應(yīng)激組飼養(yǎng)于環(huán)境溫度為35±1℃的人工氣候溫室，相對濕度80 %～85 %。以全價(jià)飼料(大北農(nóng)農(nóng)牧科技有限公司，小豬料)飼喂，每日早、中、晚各一次，自由飲水。分別在熱應(yīng)激的第 0、7 d、14 d 和 21 d 采集豬外周血備用。

1.2 主要試劑 豬淋巴細(xì)胞分離液購自北京索萊寶科技有限公司；TRIzol、PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser (RR047A)、TB GreenTMPremix ExTaqTMII (Tli RNaseH Plus) (RR820A)、DL2000 DNA Marker (3427A)、SYBR Green I熒光定量PCR檢測試劑盒均購自TaKaRa 公司；核酸染料購自天根生化科技(北京)有限公司；瓊脂粉購自Sigma 公司。

1.3 引物的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank 中登錄的豬 NOD1/2及炎性因子TNF-α、IFN-γ、IL-6、IL-10、IL-1β、內(nèi)參基因 GAPDH 的序列，利用 Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物(表1)，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

表1 引物序列及產(chǎn)物長度Table 1 Primer sequence and product size

1.4 實(shí)驗(yàn)豬PBMC 總RNA 的提取及反轉(zhuǎn)錄 分別于熱應(yīng)激的第 0、7 d、14 d 和 21 d，經(jīng)前腔靜脈采集實(shí)驗(yàn)豬外周抗凝血，按照豬外周血淋巴細(xì)胞分離試劑盒說明書分離其PBMCs。TRIzol 法提取PBMC的總RNA 后，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定其完整性，酶標(biāo)儀檢測 OD260nm/OD280nm比值，大于 1.8～2.0 的樣品凍存于-80 ℃冰箱備用。同時(shí)將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA，保存在 -20 ℃冰箱。

1.5 實(shí)驗(yàn)豬PBMC 熒光定量PCR(qPCR)的檢測按照 SYBR Green I qPCR 檢測試劑盒說明書，以PBMCs 反轉(zhuǎn)錄后的cDNA 為模板，以表1 中的各對引物，qPCR檢測NOD1、NOD2及炎性因子TNF-α、IFN-γ、IL-6、IL-10 和 IL-1β mRNA 的轉(zhuǎn)錄水平。反應(yīng)條件為：95 ℃ 35 s；95 ℃ 20 s、58 ℃35 s、72 ℃ 20 s、共 40 個(gè)循環(huán)；95 ℃ 15 s，60 ℃1 min；95 ℃ 15 s，溫度每升高 0.2 ℃采集熒光一次。

1.6 數(shù)據(jù)分析 采用相對定量，通過計(jì)算 2-ΔΔCt值求出目標(biāo)基因在PBMC 中的相對轉(zhuǎn)錄水平，ΔΔCt=(目的基因 Ct - 管家基因 Ct)試驗(yàn)組-(目的基因 Ct - 管家基因Ct)對照組，將對照組中不同時(shí)間點(diǎn)PBMC 所得數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理，處理組以對照組的倍數(shù)表示作圖。采用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行顯著性分析，p＜0.05表示差異顯著，p＜0.01 表示差異極顯著。多重線性回歸分析 NOD1/2 與 TNF-α、IFN-γ 等 6 種細(xì)胞炎性因子之間的相關(guān)性。

2 結(jié) 果

2.1 q PCR 方法的建立 采用SYBR Green I qPCR法檢測各目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄水平，對目標(biāo)基因的擴(kuò)增曲線、熔解曲線觀察發(fā)現(xiàn)，熱應(yīng)激不同時(shí)段豬PBMC各目標(biāo)基因的擴(kuò)增曲線均為標(biāo)準(zhǔn)的“ S”形(圖1)，且間距均勻。熔解曲線均為特異的單峰(圖2)，且起峰時(shí)間一致，表明引物特異性較好，產(chǎn)物純度高，沒有受到污染，定量結(jié)果相對穩(wěn)定，結(jié)果可信。

圖1 目的基因qPCR的擴(kuò)增曲線Fig.1 Amplification curves of target genes detected by qPCR

圖2 目的基因qPCR的熔解曲線Fig.2 Melting curves of target genes detected by qPCR

2.2 熱應(yīng)激豬 PBMC 中 NOD 樣受體 mRNA 轉(zhuǎn)錄水平的變化 與對照組相比，應(yīng)激組實(shí)驗(yàn)豬PBMC中NOD1 和NOD2 mRNA 轉(zhuǎn)錄水平在熱應(yīng)激處理的第7d顯著上調(diào)(p＜0.05)，在第14d極顯著上調(diào)(p＜0.01)，但在熱應(yīng)激處理的第21d顯著下調(diào)(p＜0.05) (圖3)。表明在熱應(yīng)激處理過程中 NOD 樣受體mRNA 的轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生了顯著的變化，推測其可能參與了豬的熱應(yīng)激調(diào)節(jié)過程。

圖3 熱應(yīng)激豬外周血淋巴細(xì)胞中NOD1/2mRNA轉(zhuǎn)錄水平的檢測結(jié)果Fig.3 The mRNA transcriptional level of NOD1/2 in PBMCs of heat-stress pigs

2.3 熱應(yīng)激豬PBMC 中炎性因子mRNA 轉(zhuǎn)錄水平的變化熱應(yīng)激條件下，豬PBMC 中 TNF-α 和IFN-γ mRNA 轉(zhuǎn)錄水平在熱應(yīng)激第 7 d、14 d 和 21 d極顯著上調(diào)(p＜0.01)。IL-10 mRNA 的轉(zhuǎn)錄水平在熱應(yīng)激第7 d 較對照組豬降低，但在第14 d 和第21 d極顯著上調(diào)(p＜0.01)。IL-1β mRNA 的轉(zhuǎn)錄水平在熱應(yīng)激的第 7 d 和第 14 d 極顯著上調(diào)(p＜0.01)，但在第 21 d 時(shí)該轉(zhuǎn)錄水平極顯著下調(diào)(p＜0.01)。IL-6 mRNA 轉(zhuǎn)錄水平在熱應(yīng)激的第7 d 顯著上調(diào)(p＜0.05)，但在第21d該轉(zhuǎn)錄水平極顯著下調(diào)(p＜0.01) (圖4)?？梢姛釕?yīng)激引起了 PBMC 中炎性因子的顯著變化。

圖4 熱應(yīng)激豬外周血淋巴細(xì)胞中炎性因子mRNA轉(zhuǎn)錄水平的檢測結(jié)果Fig.4 The mRNA transcriptional levels of inflammatory cytokines in PBMCs of heat-stress pigs

2.4 PBMC 中NOD1/2 與炎性因子的相關(guān)性分析熱應(yīng)激豬PBMC 中NOD1/2 mRNA 水平與相關(guān)炎性因子多重線性回歸分析顯示，與對照組相比，應(yīng)激組實(shí)驗(yàn)豬 PBMC 中 NOD1 與炎性因子 IFN-γ 和 IL-10之間相關(guān)系數(shù)較高，分別為0.991、0.899, NOD2 與炎性因子IFN-γ 和IL-10 相關(guān)性也較高，相關(guān)系數(shù)分別為 0.991 和 0.932。由此表明 NOD1/2 的上調(diào)均與炎性因子IFN-γ 和IL-10 存在正相關(guān)。

3 討 論

應(yīng)激與免疫之間的關(guān)系是通過神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)聯(lián)系在一起的。應(yīng)激引起下丘腦 - 垂體 - 腎上腺(HPA)軸反應(yīng), 導(dǎo)致各種激素(例如 CRH、GC、ACTH 等)分泌亢進(jìn)[9]，而這些激素又作用于各種細(xì)胞因子，從而使得應(yīng)激與機(jī)體的免疫功能緊密聯(lián)系在一起。由于高溫的作用，熱應(yīng)激比普通的應(yīng)激更為復(fù)雜。

NODs 作為固有免疫的胞質(zhì)受體，能夠識(shí)別病原體病原相關(guān)分子模式(Pathogen-associated molecular patterns，PAMP)，在宿主防御病原體的過程中起關(guān)鍵作用。NOD1/2 與相應(yīng)的配體識(shí)別后可以激活下游信號通路，如NF-κB 和絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen activated protein kinases，MAPK)信號，導(dǎo)致促炎因子分泌，并通過級聯(lián)反應(yīng)放大炎癥反應(yīng)，最后清除病原菌。Yan 等研究顯示，熱應(yīng)激通過激活capase-1 和NOD 樣受體家族組成的炎性小體最終造成小鼠肝損傷[10]。本研究通過qPCR 檢測顯示，在熱應(yīng)激的前期，NOD1 和NOD2 mRNA 轉(zhuǎn)錄水平顯著上調(diào)，這表明NOD 樣受體轉(zhuǎn)錄水平的升高是熱應(yīng)激對機(jī)體免疫系統(tǒng)早期的主要反應(yīng)。但誘導(dǎo)NOD上調(diào)的分子機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

炎癥反應(yīng)是機(jī)體對外來刺激產(chǎn)生的一種病理性反應(yīng)過程。一些細(xì)胞因子能夠顯著促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)生，如IL-1、IL-6 和 IL-8 等可以直接刺激中樞系統(tǒng)引起體溫升高，促進(jìn)炎癥細(xì)胞的聚集、活化和炎癥介質(zhì)的釋放[11]。胡艷欣等研究顯示熱應(yīng)激處理第1 d 和 3 d 時(shí)豬血清中 IL-2 水平顯著上升，TNF-α 水平也隨之上升[12]。研究顯示熱應(yīng)激狀態(tài)下，小鼠血液中 IL-1β、TNF-α、IL-6 等炎性因子的含量會(huì)急劇升高，最終導(dǎo)致機(jī)體多器官功能損傷[10,13]。本研究顯 示 豬 PBMCs 中 TNF-α、IL-10、IL-1β、IL-6、IFN-γ 等 mRNA 轉(zhuǎn)錄水平在熱應(yīng)激的第 7 d 和 14 d顯著上調(diào)，推測熱應(yīng)激誘發(fā)了機(jī)體的炎性過程。

NOD 樣受體是機(jī)體重要的胞內(nèi)識(shí)別受體，在熱應(yīng)激條件下顯著升高。相關(guān)性分析顯示，其與炎性因子 IFN-γ 和 IL-10 的變化呈正相關(guān)。推測熱應(yīng)激條件下 NOD 被激活，經(jīng)一系列的級聯(lián)反應(yīng)，激活了NF-κB 或MAPK 信號通路，介導(dǎo)了炎性因子的上調(diào)。但有關(guān)熱應(yīng)激條件下NOD 受體與炎性因子調(diào)控的確切機(jī)制還需進(jìn)一步的研究。