周 倩，唐夢君，張小燕，張 靜，唐修君，陸俊賢，高玉時

(江蘇省家禽科學(xué)研究所，江蘇 揚(yáng)州 225125)

彎曲菌(Campylobacter)是重要的人獸共患腸道病原菌，其中空腸彎曲菌(Campylobacter jejuni)和結(jié)腸彎曲菌(Campylobacter coli)最為常見，它們廣泛存在于溫血動物體內(nèi)，如家禽、豬、牛和野生鳥類腸道，其中禽類帶菌率最高[1]。彎曲菌具有活而不可培養(yǎng)狀態(tài)(Viable but nonculturable，VNC)，通過食物鏈傳播，在食品中的分布和傳播情況不穩(wěn)定，加熱和徹底煮熟食物能夠殺死該菌。在預(yù)防和控制家禽疾病的過程中，大量抗生素使用導(dǎo)致了多重耐藥彎曲菌的產(chǎn)生[2-4]。當(dāng)人類感染了具有抗性的彎曲菌時，將嚴(yán)重影響自身健康。

整合子是一種可移動元件，通常存在于質(zhì)粒和轉(zhuǎn)座子中，因其能夠捕獲、整合和表達(dá)耐藥基因而被廣泛重視。整合子由 3 個部分組成，包括 5' 和3'保守末端以及兩者之間的可變區(qū)，一個整合子能夠捕獲多種耐藥基因，基因盒的移動是細(xì)菌實(shí)現(xiàn)自我進(jìn)化的重要方式[5]。整合子- 耐藥基因盒不僅可以垂直傳播耐藥基因，而且可以借助結(jié)合性質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子、噬菌體等可移動基因元件，在同種和不同種屬細(xì)菌間水平傳播耐藥基因，誘導(dǎo)新的耐藥菌株出現(xiàn)[6]。已發(fā)現(xiàn)的100 多種基因盒大都與耐藥基因相關(guān)[7]。

本研究以2016年～2017年收集的彎曲菌為研究對象，檢測其Ⅰ型整合子流行情況和耐藥基因盒結(jié)構(gòu)；采用自然轉(zhuǎn)化法和化學(xué)消除法探究整合子的移動穩(wěn)定性，以便深入了解Ⅰ型整合子介導(dǎo)的彎曲菌耐藥性的產(chǎn)生和傳播途徑，為控制耐藥性細(xì)菌的產(chǎn)生和傳播提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料 2016年5月～2017年8月，從江蘇徐州、南通和揚(yáng)州等7 個縣市農(nóng)貿(mào)市場、超市和養(yǎng)殖場參照文獻(xiàn)[8-9]分離鑒定得到228 株空腸彎曲菌和84 株結(jié)腸彎曲菌，共計312 株。彎曲菌標(biāo)準(zhǔn)菌株NCTC11168 和大腸埃希氏菌ACTC25922 由本實(shí)驗(yàn)室保存。CCDA 培養(yǎng)基、MH 培養(yǎng)基、BHI培養(yǎng)基、瓊脂、酵母提取物、胰蛋白胨和27 種藥敏紙片購自英國OXOID 公司。SpeedSTARTMHS DNA Polymerase、MiniBEST DNA Fragment Purification Kit Ver.4.0、pMD20-T載體和E.coliDH5α Competent Cells 購自寶生物工程(大連)有限公司；細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司。

1.2 彎曲菌的藥敏試驗(yàn) 采用WHO 推薦的Kirby-Bauer (K-B)法，利用購買的 10 類 27 種抗生素藥敏紙片，根據(jù)美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(The Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI，2015)標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)并判定。

1.3 彎曲菌Ⅰ型整合子- 耐藥基因盒的檢測 根據(jù)Ⅰ型整合子(DQ149925.1) 5' 保守末端(整合酶int1)和 3' 保守末端(qacEdelta1-Sul1)基因序列，利用 Premier5 設(shè)計兩對特異性引物(表1)。引物均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

利用試劑盒提取312 株彎曲菌基因組DNA 為模板，采用 PCR 分別擴(kuò)增int1和qacEdelta1-Sul1基因，PCR 擴(kuò)增條件為：95 ℃ 1 min；95 ℃ 30 s、55 ℃30 s、72 ℃ 1 min，共30個循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠電泳后隨機(jī)選取PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序。

根據(jù)int1和qacEdelta1-Sul1基因測序結(jié)果設(shè)計Ⅰ型整合子- 耐藥基因盒引物(表1)，以 I 型整合子陽性彎曲菌基因組DNA 為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增整合子 - 耐藥基因盒，PCR 反應(yīng)條件為：95 ℃ 1 min；95 ℃ 30 s、58 ℃ 30 s、72 ℃ 4 min，共 35 個循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR 產(chǎn)物純化后克隆至 pMD20-T 載體后轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α 感受態(tài)細(xì)胞，37 ℃培養(yǎng)后于含氨芐青霉素(Amp)的LB 平板上，篩選陽性菌落由上海生工生物工程有限公司測序。

表1 靶基因引物序列及片段長度Table 1 Primer sequence and gene length

1.4 彎曲菌自然轉(zhuǎn)化試驗(yàn) 參照文獻(xiàn)[11]采用自然轉(zhuǎn)化法，將對數(shù)生長期的彎曲菌標(biāo)準(zhǔn)菌株NCTC11168 菌液稀釋至 0.5 麥?zhǔn)蠞舛?，?100 μL 菌液均勻涂布于 2 個 MH 血平板內(nèi)徑 2 cm 的區(qū)域，微需氧 42 ℃培養(yǎng) 6 h～8 h 后取 20 μL 經(jīng)檢測為耐藥基因盒陽性的菌株基因組 DNA 滴加于NCTC11168 菌苔的內(nèi)部區(qū)域，陰性對照滴加20 μL無菌PBS，每次試驗(yàn)設(shè)一個空白對照(僅接種菌液但不滴加任何溶液)。微需氧培養(yǎng)后根據(jù)1.2 和1.3 進(jìn)行藥敏試驗(yàn)及整合子- 耐藥基因盒檢測。

1.5 彎曲菌化學(xué)消除試驗(yàn) 將整合子- 耐藥基因盒陽性彎曲菌復(fù)蘇于CCDA 平板和MH 血平板，挑取適量MH 血平板菌落加入含0.1 % SDS MH 肉湯培養(yǎng)基(含 5 %無菌馬血清)，取 50 μL 肉湯培養(yǎng)菌液涂布于MH 血平板，空白對照為陽性菌株接種于不含SDS MH 肉湯培養(yǎng)基(含5%無菌馬血清)，質(zhì)控對照為接種彎曲菌NCTC11168。微需氧培養(yǎng)36 h 后根據(jù)1.2 和1.3 進(jìn)行藥敏試驗(yàn)及整合子- 耐藥基因盒檢測。若整合子未能消除，重復(fù)上述化學(xué)消除步驟。

1.6 數(shù)據(jù)處理 分析int1、qacEdelta1-Sul1和耐藥基因盒測序結(jié)果，利用BioEdit 和SeqMan 軟件對序列拼接后進(jìn)行BLAST 比對分析；耐藥率變化數(shù)據(jù)采用SAS 9.2 進(jìn)行卡方檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 Ⅰ型整合子- 耐藥基因盒流行特征

2.1.1 Ⅰ型整合子在雞源彎曲菌中的流行情況 通過PCR 方法擴(kuò)增312 株雞源彎曲菌中的Ⅰ型整合子的int1基因和qacEdelta1-Sul1基因。PCR 及測序結(jié)果顯示128 株彎曲菌攜帶int1基因，陽性率為41%。在128 株int1基因陽性彎曲菌中，僅有58 株彎曲菌攜帶Ⅰ型整合子qacEdelta1-Sul1，陽性率為18.6 %。表明312 株彎曲菌中，攜帶int1基因的菌株不一定攜帶Ⅰ型整合子qacEdelta1-Sul1，但是攜帶Ⅰ型整合子qacEdelta1-Sul1的菌株一定攜帶int1基因。部分彎曲菌int1基因和qacEdelta1-Sul1基因 PCR 擴(kuò)增結(jié)果見圖1。

2.1.2 Ⅰ型整合子- 耐藥基因盒檢測結(jié)果及其結(jié)構(gòu)58 株含完整Ⅰ型整合子彎曲菌株中，經(jīng)PCR 擴(kuò)增測序，結(jié)果顯示15 株菌株(5 株結(jié)腸彎曲菌和10 株空腸彎曲菌)可變區(qū)均檢出耐藥基因aadA1，其余菌株的整合子可變區(qū)未檢測到耐藥基因盒(圖2)。aadA1耐藥基因編碼對氨基糖苷類抗生素耐藥。本研究中整合子- 耐藥基因盒結(jié)構(gòu)圖譜見圖3，5' 和 3'保守末端分別為int1基因和qacEdelta1-Sul 1基因，外源耐藥基因aadA1通過識別整合子重組位點(diǎn)attI插入到整合子可變區(qū)中，從而使該菌株表現(xiàn)出對氨基糖苷類抗生素的耐藥性。

圖1 彎曲菌I型整合子的PCR擴(kuò)增Fig.1 The identification of the class I integron in Campylobacter by PCR

圖2 彎曲菌整合子-耐藥基因盒的PCR擴(kuò)增Fig.2 The amplification of gene cassette in the variable region by PCR

圖3 彎曲菌Ⅰ型整合子攜帶aadA1 基因模式圖Fig.3 The schematic diagram of the class 1 integron carrying the aadA1 gene

2.2 彎曲菌的自然轉(zhuǎn)化試驗(yàn)結(jié)果及分析 以15 株aadA1陽性彎曲菌基因組為供體，以遺傳背景清晰的敏感菌株空腸彎曲菌NCTC11168 為受體菌進(jìn)行自然轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示本實(shí)驗(yàn)獲得6 株aadA1基因陽性的自然轉(zhuǎn)化子，轉(zhuǎn)化率為40 %。

對27 種抗生素的藥敏檢測結(jié)果顯示，6 株自然轉(zhuǎn)化子與陰性對照組彎曲菌相比，其對大多數(shù)抗生素的抑菌圈縮小，表明自然轉(zhuǎn)化子獲得整合子結(jié)構(gòu)后能夠產(chǎn)生耐藥性；而9 株接合失敗的菌株顯示對這些抗生素的抑菌圈增大或不變(表2)，表明大多數(shù)彎曲菌仍然保持對藥物的敏感性。

表2 彎曲菌自然轉(zhuǎn)化前后耐藥表型變化Table 2 The phenotypic change of drug resistance of the Campylobacters after natural transformation

2.3 彎曲菌化學(xué)消除試驗(yàn)結(jié)果及分析 將攜帶aadA1基因盒的耐藥彎曲菌進(jìn)行整合子- 耐藥基因盒消除試驗(yàn)。15 株彎曲菌經(jīng)過0.1 % SDS 化學(xué)處理，5 株彎曲菌能夠一次化學(xué)消除整合子結(jié)構(gòu)，所有菌株經(jīng)5 次處理以后，PCR 未檢測到整合子。表明經(jīng)0.1% SDS 化學(xué)處理能夠成功消除整合酶int1基因。部分彎曲菌株消除整合酶int1基因前后的PCR 檢測結(jié)果見圖4。

經(jīng)0.1% SDS 化學(xué)處理后，部分抗菌藥物耐藥率在消除整合酶int1基因前后發(fā)生改變。其中對氨基糖苷類抗生素的耐藥率變化最大，其它藥物均未發(fā)生明顯變化(表3)。表明隨著整合子- 耐藥基因盒的消除，部分菌株對氨基糖苷類藥物耐藥性發(fā)生逆轉(zhuǎn)。

圖4 部分彎曲菌菌株整合酶基因消除前后的PCR鑒定Fig.4 The identification of the isolates with the int1 gene before and after eliminating by PCR

表3 化學(xué)消除試驗(yàn)前后彎曲菌耐藥性變化Table 3 The change of antibiotic resistance rate before and after chemical eliminating

3 討 論

彎曲菌作為一種重要的人獸共患病病原菌，不僅能夠引起人類和動物細(xì)菌性腹瀉，還可以引起格林- 巴利綜合征[12]。本研究中彎曲菌的Ⅰ型整合子陽性率為18.6 %，采用PCR 擴(kuò)增Ⅰ型整合子的可變區(qū)，測序比對結(jié)果顯示15 株彎曲菌均擴(kuò)增出1 825 bp大小相同的條帶，為氨基糖苷類抗生素耐藥基因aadA1，基因盒單一。

在自然條件下，細(xì)菌攝取外源DNA 并轉(zhuǎn)化為自身遺傳物質(zhì)，該過程稱為自然轉(zhuǎn)化[11]。通常情況下，耐藥基因可以通過轉(zhuǎn)座子和整合子等可移動元件在質(zhì)?；蚴侨旧w間遷移擴(kuò)散[13]。本研究表明在實(shí)驗(yàn)室條件下，I 型整合子能夠由供體菌DNA 自然轉(zhuǎn)化到受體彎曲菌NCTC11168 中，轉(zhuǎn)化率為40 %。而鄧鳳如證明在實(shí)驗(yàn)室條件下aadE-Sat4-aphA3及其氨基糖類耐藥基因島(type I、type II 和 type III)均能夠通過自然轉(zhuǎn)化的方式由耐藥供體菌C.coli轉(zhuǎn)移到敏感受體菌C.jejuniNCTC11168，發(fā)生了跨彎曲菌亞種的傳播，轉(zhuǎn)化率達(dá)100 %[11]?；诂F(xiàn)有的研究和自然轉(zhuǎn)化試驗(yàn)的結(jié)果，本研究推測彎曲菌中的aadA1基因盒是通過自然轉(zhuǎn)化的方式傳播，但彎曲菌不同于其它的大多數(shù)細(xì)菌，苛刻的培養(yǎng)環(huán)境導(dǎo)致了其傳播過程的穩(wěn)定性。此外，彎曲菌中整合位點(diǎn)的多樣性和選擇性也影響自然轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化率。獲取外源DNA 的細(xì)菌通常能夠獲得抗藥性和致病性[14-15]，整合子的成功轉(zhuǎn)化表明受體菌株獲得整合子后獲得部分耐藥性。以此推斷，多重耐藥彎曲菌可以通過食品源動物將細(xì)菌耐藥性傳遞給人類，造成其耐藥性增加。自然轉(zhuǎn)化成功表明整合子能夠通過同源重組的方式使耐藥基因盒在彎曲菌中發(fā)生水平傳播。

在實(shí)驗(yàn)室條件下，采用化學(xué)消除法能夠消除耐藥基因盒從而消除細(xì)菌耐藥性，本研究消除氨基糖苷類抗生素耐藥基因盒前后，彎曲菌耐藥率變化明顯，表明整合子- 耐藥基因盒消除能夠部分逆轉(zhuǎn)彎曲菌的耐藥性。而化學(xué)消除雖然操作便捷，但消除率低。有研究顯示用中藥(如三黃片和艾葉草)對臨床分離的大腸桿菌耐藥質(zhì)粒的消除率為31 %和60 %[16-17]，本研究利用SDS 對彎曲菌第一輪的消除率為33 %，與三黃片消除效果相當(dāng)。

綜上所述，雖然化學(xué)消除能夠一定程度消除細(xì)菌對抗生素的耐藥性，但隨著接合的發(fā)生使耐藥消除菌株又重新獲得耐藥性，給疾病防治和耐藥性阻斷帶來很大困難。單純消除整合子耐藥基因盒結(jié)構(gòu)在致病菌耐藥性流行的防控中難以取得明顯效果，因此，在家禽養(yǎng)殖中需要強(qiáng)化科學(xué)用藥、精準(zhǔn)用藥，以提高禽產(chǎn)品質(zhì)量安全控制水平，加強(qiáng)食品安全風(fēng)險管理。