郭運(yùn)澤，孫恩成，徐青元，步志高，吳東來*，王鳳龍1,*

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 獸醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所 獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)部獸醫(yī)公共衛(wèi)生重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150069)

藍(lán)舌病是由藍(lán)舌病病毒(Bluetongue virus，BTV)引起的，導(dǎo)致多種反芻動(dòng)物及野生動(dòng)物發(fā)病的急性熱性疾病。由于該病傳播迅速以及其在全球范圍內(nèi)造成的嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)影響，被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)列為法定通報(bào)疾病，在我國也被列為一類動(dòng)物疫病。由于近年來藍(lán)舌病在歐洲的暴發(fā)，且傳播范圍的不斷擴(kuò)大，藍(lán)舌病的防控已成為我國乃至國際社會(huì)關(guān)注的重要?jiǎng)游镆卟　TV 是一種隸屬于呼腸孤病毒科環(huán)狀病毒屬的蟲媒病毒。其基因組由10 條線性化的雙鏈RNA組成。BTV 的病毒粒子呈二十面體對(duì)稱，無囊膜，直徑約為 70 nm～80 nm。BTV 的核酸由10 個(gè)基因節(jié)段的雙股RNA (double-stranded RNA，dsRNA)組成，按長度大小依次命名為 Seg-1～Seg-10。BTV 的 10 個(gè)雙股 RNA 節(jié)段總長度約 19.2 kb，分別編碼7 種結(jié)構(gòu)蛋白(VP1～VP7)和4 種非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1、NS2、NS3/NS3A、NS4)[1]。

本研究所采用的10 質(zhì)粒拯救系統(tǒng)操作過程比現(xiàn)有的體外轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)簡便，可豐富dsRNA 病毒的反向遺傳操作系統(tǒng)。同時(shí)，該系統(tǒng)為BTV 發(fā)病機(jī)理等方面的基礎(chǔ)研究以及新型疫苗研發(fā)方面的應(yīng)用性研究奠定了一定的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料 親本病毒BTV-16 BN96/16 株(wtBTV-16)和BHK-21、BSR 細(xì)胞均由本實(shí)驗(yàn)室保存；攜帶 BTV-16 BN96/16 株的 Seg-1～Seg-10 的重組質(zhì)粒pB16-s1～pB16-s10 均由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建保存；反向遺傳操作系統(tǒng)通用載體pS111(圖1)由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建保存[2]；抗 BTV-16 NS2 蛋白的單克隆抗體(MAb)腹水BTV-NS2-1B2 由本實(shí)驗(yàn)室制備保存[3]。

RESRAD-BIOTA廣泛應(yīng)用于美國能源部的部門和項(xiàng)目，以及美國多個(gè)洲的環(huán)保部門。同時(shí)，該軟件還用于IAEA的EMRAS項(xiàng)目中各種軟件在不同場景中的對(duì)比研究中。

1.2 主要試劑 DNA 聚合酶KOD FX 購自TOYOBO公司；限制性內(nèi)切酶AarI、BbsI、BsaI和BsmB I均購自Thermo Fisher公司；Quick Ligation酶購自NEB公司；TransI 感受態(tài)細(xì)胞購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；Plasmids midi kit 購自QIAGEN 公司；Opti-MEM 培養(yǎng)基購自Gibco 公司；轉(zhuǎn)染試劑 LipofectamineLTX & PLUSTMReagent購自Invitrogen 公司；FITC 標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG(IgG-FITC)購自Sigma 公司。引物由安徽通用生物技術(shù)有限公司合成。

2.1 病毒10 個(gè)基因節(jié)段的擴(kuò)增與反向遺傳質(zhì)粒的構(gòu)建 采用10 對(duì)引物以BTV-16 病毒基因組為模板PCR 擴(kuò)增各基因節(jié)段，分別得到S1～S10 10 個(gè)基因節(jié)段的 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物，其長度依次約為4 000 bp、3 000 bp、2 800 bp、2 000 bp、1 800 bp、1 600 bp、1 200 bp、1 100 bp、1 000 bp 和 800 bp，經(jīng)測序顯示擴(kuò)增產(chǎn)物均與預(yù)期一致(圖2)。將各個(gè)基因采用相應(yīng)的酶切后克隆至pS111 載體中，將陽性克隆的測序結(jié)果登錄GenBank(分別為JN671906～JN671915)，比對(duì)結(jié)果顯示，10 個(gè)陽性克隆基因節(jié)段的序列與相應(yīng)基因標(biāo)準(zhǔn)序列的相似性均為100 %，表明本實(shí)驗(yàn)正確構(gòu)建了重組質(zhì)粒pS161～pS1610。

圖1 10質(zhì)粒系統(tǒng)拯救BTV的實(shí)驗(yàn)策略以及pS111的質(zhì)粒圖譜Fig.1 Experimental strategy to rescue BTV from 10 plasmids and the diagram of pS111

1.3.1 BTV-16 基因組引物的設(shè)計(jì)和片段的擴(kuò)增根據(jù) BTV-16 的基因序列，利用 Primer Premier 5 軟件分別針對(duì)BTV-16 的10 個(gè)基因節(jié)段 Seg-1～Seg-10設(shè)計(jì)含不同酶切位點(diǎn)的上下游引物(表1)。以BTV-16 重組質(zhì)粒為模板，利用 KOD FX 通過 PCR方法擴(kuò)增病毒的10 個(gè)基因節(jié)段的全長序列。

表1 擴(kuò)增BTV-16 基因組所用引物Table 1 Primers for the BTV-16 genome cDNA amplification

1.3.2 10 個(gè)重組質(zhì)粒的構(gòu)建 將上述獲得的10 個(gè)PCR 產(chǎn)物回收，根據(jù)各對(duì)引物設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)分別酶切純化處理后，使用Quick Ligation 分別將目的片段克隆至同樣酶切純化的pS111 載體，轉(zhuǎn)化后挑取單克隆測序鑒定。將鑒定正確的重組質(zhì)粒依次命名為 pS161～pS1610。

1.4 質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染和重組病毒的拯救 對(duì)構(gòu)建的10個(gè)重組質(zhì)粒，按照Plasmids midi kit 說明書進(jìn)行質(zhì)粒抽提。經(jīng)超微量紫外分光光度計(jì)測定濃度后，根據(jù)各基因節(jié)段的大小轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的質(zhì)量pS161～pS1610依次為 1 600 ng、1 350 ng、1 300 ng、1 100 ng、1 050 ng、1 050 ng、900 ng、900 ng、900 ng 和 800 ng。將中提后的10 個(gè)重組質(zhì)粒按照LipofectamineLTX & PLUSTMReagent 說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染。在轉(zhuǎn)染單層 BSR 細(xì)胞 6 h 后補(bǔ)加含 5 %FBS 的 DMEM 培養(yǎng)液，于 37 ℃ 5 % CO2條件下持續(xù)培養(yǎng)，并觀察細(xì)胞病變(CPE)。同時(shí)，以僅加入不含轉(zhuǎn)染試劑的單層BSR 細(xì)胞作為空白對(duì)照。當(dāng)觀察到細(xì)胞約有80%出現(xiàn) CPE 時(shí)，收集細(xì)胞及上清，凍融 3 次后，收集病毒液，經(jīng) BHK-21 細(xì)胞連續(xù)傳代。經(jīng)鑒定后，將拯救病毒命名為rBTV-16，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.4 拯救病毒基因組的測序鑒定 參照Maan 等[5]建立的用于dsRNA 病毒全長(包括兩端非編碼區(qū)序列)基因測序的cDNA 擴(kuò)增法(Full-length amplification of cDNAs，F(xiàn)LAC)，進(jìn)行 rBTV-16 的 S1～S10 基因節(jié)段的PCR 擴(kuò)增并測序，比對(duì)分析拯救病毒與親本病毒的基因組序列。

1.5 拯救病毒的鑒定

1.5.1 間接免疫熒光(IFA)鑒定檢測 將拯救的病毒在 BHK-21 細(xì)胞傳至第 5 代后，以 BTV-NS2-1B2 MAb (1∶100)為一抗，山羊抗小鼠 IgG-FITC (1∶200)為二抗，按照常規(guī)方法進(jìn)行IFA 的檢測。設(shè)未感染拯救病毒的BHK-21 細(xì)胞為空白對(duì)照。

2.5 拯救病毒dsRNA 基因組鑒定 利用TRIzol LS試劑提取病毒液中病毒總RNA，經(jīng)過純化后可獲得除去ssRNA 后的病毒基因組 dsRNA。經(jīng) 10 %的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分析，結(jié)果顯示rBTV-16的10 個(gè)基因節(jié)段的dsRNA 條帶與帶wtBTV-16 一一對(duì)應(yīng)(圖5)，大小也完全一致。表明正確拯救重組病毒rBTV-16。

1.5.3 病毒dsRNA 基因組的電泳檢測 利用TRIzol鑒定法提取rBTV-16 及其親本病毒wtBTV-16 的總RNA，參照 Attoui[4]和 Maan[5]等的方法獲得去除 ss-RNA 后的病毒基因組dsRNA。使用非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測病毒的dsRNA 基因組。

景觀中常用的裝飾混凝土有多種類型，其中比較常見的有清水混凝土、彩色混凝土、異型混凝土（GRC、泰科石等），露骨料裝飾混凝土等。

2.6 拯救病毒的基因組測序 將提取的病毒RNA反轉(zhuǎn)錄后利用PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物測序結(jié)果顯示拯救病毒與親本病毒序列完全一致。進(jìn)一步表明拯救出的病毒確為目的病毒。

我不知道到哪里去找尋白麗筠，打她的手機(jī)停機(jī)，上網(wǎng)QQ呼她，頭像是灰的，我留心各種媒體報(bào)道的車禍?zhǔn)鹿?，甚至去我們這座小城的所有水域巡查，沒有任何疑似消息，一概沒有。我痛感到我與白麗筠的聯(lián)系其實(shí)多么脆弱，就像孩子手里的一只風(fēng)箏，只要一陣風(fēng)就把我們徹底拆散了，再也找不到。最后，我去了白麗筠工作的售樓部，明知道沒有用，還是去了。售樓部經(jīng)理說，白麗筠已經(jīng)辭職了。“辭職”兩個(gè)字讓我冰涼的心里升起一絲暖意，既然白麗筠想到要辭職，就不像是一個(gè)要去自殺的人。

2 結(jié) 果

1.3 病毒基因組的擴(kuò)增和反向遺傳質(zhì)粒的構(gòu)建10 質(zhì)粒系統(tǒng)拯救BTV 的原理如圖1所示[2]。

圖2 BTV16 10個(gè)基因節(jié)段的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 Amplification of 10 gene segments of BTV-16 by PCR

2.2 反向遺傳重組病毒的拯救 待BSR 細(xì)胞長成單層時(shí)轉(zhuǎn)染10 個(gè)質(zhì)粒，培養(yǎng)后觀察可見實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞出現(xiàn) CPE，而對(duì)照組無 CPE。表明拯救得到重組病毒。

2.3 拯救病毒的 IFA鑒定將rBTV-16 感染BHK-21 細(xì)胞 24 h 后經(jīng) IFA 鑒定，結(jié)果顯示感染rBTV-16 的BHK-21 細(xì)胞中可見明顯的綠色熒光(圖3) 。表明拯救的重組病毒可以感染BHK-21 細(xì)胞。

路燈心跳的主要目的是?；顟?yīng)用層連接，屬于非必須功能，尤其考慮通信按連接收取資費(fèi)，客戶可能會(huì)減少甚至取消心跳；因此路燈心跳時(shí)間Tm參數(shù)設(shè)計(jì)為可配變量，當(dāng)前IoT平臺(tái)設(shè)定的應(yīng)用層老化時(shí)間一般為30min，建議設(shè)置為25min。如果心跳過于頻繁，會(huì)對(duì)網(wǎng)絡(luò)資源、用戶資費(fèi)造成浪費(fèi)。

圖3 IFA鑒定拯救的重組病毒感染BHK-21細(xì)胞的結(jié)果Fig.3 Identification of the rBTV-16 in infected BHK-21 cells by IFA

2.4 拯救病毒的電鏡觀察 收集病毒液，經(jīng)處理后在透射電子顯微鏡下觀察，可見直徑約為70 nm 的病毒粒子，無囊膜(圖4)，拯救的重組病毒的形態(tài)為典型的環(huán)狀病毒屬病毒粒子形態(tài)。表明拯救的重組病毒形態(tài)標(biāo)準(zhǔn)。

圖4 拯救病毒的電鏡照片F(xiàn)ig.4 Morphological examination of rBTV1 by electron microscope(Bar=200 nm)

1.5.2 電鏡觀察 將拯救的rBTV-16 在BHK-21 細(xì)胞中增殖，觀察到細(xì)胞出現(xiàn)80 % CPE 時(shí)反復(fù)凍融，按常規(guī)方法經(jīng)負(fù)染后電鏡觀察病毒形態(tài)。

目前，國內(nèi)主要采用體外轉(zhuǎn)錄法進(jìn)行病毒的拯救。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，該方法主要是通過先轉(zhuǎn)染真核表達(dá)質(zhì)粒表達(dá) VP1、VP3、VP4、VP6、VP7、NS1、NS2 幾個(gè)輔助蛋白，再轉(zhuǎn)染帶 5' 帽結(jié)構(gòu)的 T7 體外轉(zhuǎn)錄物進(jìn)行病毒的拯救[6-7]。該反向遺傳操作系統(tǒng)也被用來拯救呼腸孤病毒科環(huán)狀病毒屬的其它成員，如非洲馬瘟病毒(Efrican horse sickness virus，AHSV)、鹿流行性出血熱病毒(epizootic hemorrhagic disease virus，EHDV)等[8-9]。而國外已經(jīng)建立兩種反向遺傳操作系統(tǒng)：一種為先轉(zhuǎn)染7 個(gè)輔助質(zhì)粒，后轉(zhuǎn)染體外獲得的10 個(gè)帽化或非帽化的RNA，最后收獲拯救病毒[8]；另一種為10 質(zhì)粒拯救系統(tǒng)。本實(shí)驗(yàn)室在2014年根據(jù)國外發(fā)表文獻(xiàn)已經(jīng)構(gòu)建7 個(gè)輔助質(zhì)粒加10 個(gè)體外轉(zhuǎn)錄RNA 共轉(zhuǎn)染拯救系統(tǒng)[8]，但是該系統(tǒng)效率較低，費(fèi)時(shí)費(fèi)力。為了優(yōu)化BTV 的拯救，本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了10 質(zhì)粒拯救系統(tǒng)，這在國內(nèi)目前尚屬首次報(bào)道。

圖5 BTV-16基因組的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳Fig.5 Detection of the genomic dsRNA of rBTV-16 in an 10%non-denaturing polyacrylamide gel

1.6 拯救病毒與親本病毒的生長曲線測定 待BHK-21 細(xì)胞匯聚成單層時(shí)將rBTV-16 與wtBTV-16傳至第 5 代，分別以 MOI 0.1感染細(xì)胞，接毒 1 h 后棄去病毒液，PBS 洗兩遍后更換 5 %FBS 的DMEM。每間隔 12 h 收取細(xì)胞上清液，測定病毒TCID50并繪制生長曲線。

2.7 拯救病毒與親本病毒生長曲線的測定 將rBTV-16與wtBTV-16分別感染BHK-21細(xì)胞，經(jīng)TCID50測定并繪制二者的生長曲線。結(jié)果顯示，rBTV-16 與wtBTV-16 具有相似的生長曲線，且最高病毒滴度可達(dá) 1×107TCID50/mL 以上(圖6)。表明拯救的重組病毒的復(fù)制能力與其親本病毒的復(fù)制能力相當(dāng)。

圖6 拯救病毒與親本病毒的生長曲線Fig.6 The growth curves of rBTV-16 and its parental virus of wtBTV-16

3 討 論

3.5.2飼料配方小雞階段：玉米58%、豆粕30%、魚粉5%、酵母3%、油脂1%、骨粉1.5%、食鹽0.5%、預(yù)混合飼料1%。中雞階段：玉米62%、豆粕27%、魚粉3%、酵母3%、油脂2%、骨粉1.5%、食鹽0.5%、預(yù)混合飼料1%。大雞階段：玉米65%、豆粕23%、魚粉2%、酵母4%、油脂3%、骨粉1.5%、食鹽0.5%、預(yù)混合飼料1%。

本研究前期采用重疊延伸PCR 方法構(gòu)建了反向遺傳質(zhì)粒pS111。以pUC57 載體為骨架分別加入T7 RNA 聚合酶啟動(dòng)子序列、限制性酶切位點(diǎn)序列、丁型肝炎核酶序列和T7 RNA 聚合酶終止子序列構(gòu)建的重組質(zhì)粒作為載體，并命名為pS111[2]。本研究采用的反向遺傳構(gòu)建的載體pS111，在BTV 基因節(jié)段合成的cDNA 5' 端含有T7 RNA 聚合酶啟動(dòng)子序列，3' 端含有 HDVR 和 T7 RNA 聚合酶終止子序列；利用HDVR 的自剪切活性，保證了目的基因在3' 端的真實(shí)性[1]。在體外轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)中，由于在5' 端需要添加帽結(jié)構(gòu)，在使用帽化酶情況下可能僅一部分T7轉(zhuǎn)錄物形成了該結(jié)構(gòu)，除了影響翻譯過程外，也可能影響RNA 的包裝、負(fù)鏈的合成以及下一輪感染的轉(zhuǎn)錄過程；同時(shí)在體外轉(zhuǎn)錄過程中，可能產(chǎn)生比目的基因或長或短的轉(zhuǎn)錄物，這些有缺陷的轉(zhuǎn)錄物很可能會(huì)影響病毒的拯救效率[2,5]。

因?yàn)樗蠦TV 基因節(jié)段的5' 端和3' 端各具有4個(gè)保守的核苷酸序列，所以本研究設(shè)計(jì)選用AarI、BbsI、BsaI、BsmB I 這幾種限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)序列，使得PCR 產(chǎn)物酶切后得到相應(yīng)的保守序列粘性末端，并應(yīng)用于所有BTV 基因節(jié)段的克隆[6]。

反向遺傳系統(tǒng)不僅能夠推進(jìn)BTV 的基礎(chǔ)研究，包括病毒的復(fù)制、入侵、包裝，還可以應(yīng)用于基因工程疫苗的研究。尤其是拯救不同基因節(jié)段相互替換的基因重組病毒，可以作為篩選針對(duì)不同血清型BTV 的疫苗株。國外已經(jīng)有報(bào)道通過基因節(jié)段替換拯救出可應(yīng)用于后續(xù)疫苗研發(fā)的病毒株[9-10]。

選擇我院2016年1月-2017年12月急診室收治的130例下肢骨折患者,將130例患者入院時(shí)護(hù)理模式不同進(jìn)行分組,常規(guī)急診護(hù)理患者設(shè)定為對(duì)照組,循證護(hù)理治療患者為觀察組,每組有患者65例,對(duì)照組:男性35例,女性30例,年齡18-78歲,平均(42.5±6.3)歲;觀察組:男性36例,女性29例,年齡18-79歲,平均(41.5±6.4)歲;兩組一般資料無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,P>0.05。

其實(shí)，在上世紀(jì)70年代時(shí)，運(yùn)用在鐘表機(jī)心上的防震器種類繁多，而KIF防震器與Incabloc防震器相較之功能優(yōu)異、產(chǎn)量大而品質(zhì)穩(wěn)定，許多同時(shí)期的防震器，因制造昂貴與維修不易，逐漸被大部分的表廠所舍棄。

本研究建立了一個(gè)全新的系統(tǒng)擴(kuò)展了現(xiàn)有的BTV 反向遺傳操作平臺(tái)，不僅在很大程度上減少了試劑的花費(fèi)、實(shí)驗(yàn)的周期，而且提高了病毒拯救的效率?？紤]到環(huán)狀病毒具有相似的結(jié)構(gòu)和復(fù)制機(jī)制，該系統(tǒng)也可以應(yīng)用于其它環(huán)狀病毒屬成員的反向遺傳操作。