張志強(qiáng)，李巧玲，肖麗榮，蘇碩青，李永慧，吳同壘，王洪彬，王雙月，朱國(guó)強(qiáng)，史秋梅*

(1.河北科技師范學(xué)院 河北省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 秦皇島 066004；2.秦皇島市第二醫(yī)院，河北 昌黎 066600；3.揚(yáng)州大學(xué)，江蘇 揚(yáng)州 225009)

遲緩愛德華菌(Edwardsiella tarda)是水產(chǎn)養(yǎng)殖中的重要病原，能夠感染多種魚類，造成極為嚴(yán)重的損失。值得重視的是，E.tarda還可以通過(guò)食源途徑感染人，引起胃腸炎、敗血癥，因此具有重要公共衛(wèi)生學(xué)意義[1-2]。E.tarda為胞內(nèi)寄生菌，其能夠侵染宿主多種細(xì)胞并于胞內(nèi)長(zhǎng)期存活，這是其造成長(zhǎng)期感染的重要原因[3]。研究E.tarda致病機(jī)制，探究其體內(nèi)存活的關(guān)鍵因子，對(duì)于臨床上E.tarda病的防控具有重要意義。

莽草酸途徑是廣泛存在于植物、真菌和微生物中的重要的代謝途徑，參與合成多種生物體必須物質(zhì)，對(duì)于生物生存至關(guān)重要。莽草酸途徑涉及多個(gè)酶化過(guò)程，需要多種酶的參與，關(guān)鍵酶的缺失會(huì)引起生物體表型的改變甚至死亡。前期對(duì)沙門菌研究發(fā)現(xiàn)，將其莽草酸合成途徑關(guān)鍵因子5- 烯醇丙酮酸-3- 磷酸合成酶編碼基因aroA 失活后獲得的營(yíng)養(yǎng)缺陷菌株致病力顯著下降，該菌株作為疫苗使用具有良好的保護(hù)效果[4-5]。MenF 是細(xì)菌所編碼的一種異分支酸合成酶，也屬于莽草酸途徑的關(guān)鍵酶，該酶主要參與生物體合成2,3- 二羥基苯甲酸和甲基萘醌類物質(zhì)，這些物質(zhì)是細(xì)菌鐵攝取和呼吸鏈所必不可少的，那么MenF 是否也影響細(xì)菌的致病性呢？ 本研究對(duì)E.tarda異分支酸編碼基因menF進(jìn)行敲除，并分析其對(duì)細(xì)菌生物學(xué)特性的影響，為E.tarda病防控提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料 致病性E.tardaET-CL 分離菌株分離自秦皇島市某大菱鲆養(yǎng)殖場(chǎng)，由河北科技師范學(xué)院動(dòng)物傳染病研究室分離、鑒定和保存。自殺載體 pRE112、DH5α (λPir)以及 WM3064 (二氨基庚二酸DAP 缺陷大腸桿菌)菌株由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)單曉楓教授惠贈(zèng)。實(shí)驗(yàn)用斑馬魚(3 cm～4 cm)購(gòu)自昌黎碣石花鳥魚市場(chǎng)，實(shí)驗(yàn)前在本實(shí)驗(yàn)室預(yù)養(yǎng)1 周，以適應(yīng)環(huán)境。LATaqDNA 聚合酶購(gòu)自TaKaRa 公司；限制性內(nèi)切酶及 T4 連接酶均購(gòu)自Thermo 公司；DH5 感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；基因組提取試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒購(gòu)自O(shè)MEGA 公司；鐵螯合劑 2, 2'- 聯(lián)吡啶(DIP)購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；小鼠抗MenF 多抗血清由河北科技師范學(xué)院動(dòng)物傳染病研究室制備保存；HRP 標(biāo)記山羊抗小鼠IgG (H+L)抗體購(gòu)自康為世紀(jì)生物科技有限公司。

1.2DmenF融合片段的構(gòu)建 根據(jù)GenBank 中登錄的E.tarda參考菌株基因組序列(CP001135.1)設(shè)計(jì)特異性引物用于擴(kuò)增menF基因上下游片段F1 和F2(表1)。

利用細(xì)菌基因組提取試劑盒提取E.tardaET-CL株基因組，并以其為模板 PCR擴(kuò)增F1和F2片段，利用膠回收試劑盒回收目的基因后將F1 和F2 片段等量混合，取 1 μL 混合物做模板，利用 P1/P4 引物擴(kuò)增，獲得 F1、F2 相連接的融合片段 DmenF，利用膠回收試劑盒回收融合片段，將其克隆至pMD18-T 載體，構(gòu)建 pMD18-T-DmenF，由北京生工生物工程有限公司測(cè)序鑒定。

表1 實(shí)驗(yàn)所用的引物及序列Table 1 Primers used in this study

1.3 pRE112-menF 重組自殺載體的構(gòu)建 利用KpnⅠ和SacⅠ分別對(duì) pMD18-T-DmenF和 pRE112 空載體雙酶切后回收融合片段DmenF和載體片段按照3∶1 比例連接，轉(zhuǎn)入 DH5α (λpir)感受態(tài)細(xì)胞中。挑取克隆進(jìn)行PCR 驗(yàn)證，提取陽(yáng)性重組質(zhì)粒雙酶切驗(yàn)證，即得到重組自殺載體pRE112-menF。

1.4E.tardaET-CLΔmenF株的篩選與鑒定 將重組載體 pRE112-menF 轉(zhuǎn)化入 WM3064 中(即為供體菌)。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的供體菌和E.tardaET-CL 菌株(受體菌)按照 3∶1 比例混合，共培養(yǎng) 24 h；將培養(yǎng)物涂布于含有氯霉素抗性的營(yíng)養(yǎng)瓊脂，長(zhǎng)出菌落即含有自殺載體的E.tarda。獲得菌株于10 %蔗糖平板上劃線，進(jìn)行自殺載體丟失，對(duì)生長(zhǎng)菌落進(jìn)行抗性檢測(cè)，選取無(wú)氯霉素抗性菌落以P5/P6 鑒定引物進(jìn)行PCR 檢測(cè)，產(chǎn)物由北京生工生物工程有限公司測(cè)序鑒定。通過(guò)上述方法獲得E.tarda menF基因缺失株，即 ET-CLΔmenF(簡(jiǎn)寫為 KO)。

以ET-CL 基因組為模板，利用P7/P8 引物擴(kuò)增menF基因片段，將其克隆到 pACYC184 質(zhì)粒中。將構(gòu)建的回補(bǔ)質(zhì)粒 pACYC-184menF轉(zhuǎn)化至 ET-CLΔmenF株中，構(gòu)建回補(bǔ)菌株 pACYC184menF/ET-CLΔmenF(簡(jiǎn)寫為 RS)。

分別將E.tarda3 個(gè)菌株進(jìn)行SDS-PAGE 電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，以MenF小鼠抗MenF多抗(1∶500 稀釋)作為一抗，羊抗鼠 IgG(H+L)為二抗(1∶10 000稀釋)，western blot 鑒定E.tardaMenF 蛋白表達(dá)。

1.5 ET-CLΔmenF的生物學(xué)特性檢測(cè) 分別將E.tarda3 個(gè)菌株接種液體 LB 中，30 ℃培養(yǎng)過(guò)夜，次日按 1∶50 轉(zhuǎn)接新鮮 LB 或 M9 培養(yǎng)基，30 ℃同步振搖培養(yǎng)；每隔 2 h 吸取菌液樣品，測(cè)定其吸光度OD540nm值，繪制3 個(gè)菌株的生長(zhǎng)曲線。

利用梅里埃(ATB)自動(dòng)生化鑒定系統(tǒng)對(duì)E.tarda3 個(gè)菌株進(jìn)行生化特性分析：將待檢菌株于營(yíng)養(yǎng)瓊脂上劃線培養(yǎng)，刮取菌落重懸于無(wú)菌生理鹽水，調(diào)整菌體濃度至麥?zhǔn)蠞岫葹?.5，將菌液滴于 ID32E生化鑒定卡檢測(cè)孔中，40 μL/ 孔。置于濕盒中 30 ℃培養(yǎng)24 h 后上機(jī)檢測(cè)。

1.6 ET-CLΔmenF株對(duì)鐵利用的測(cè)定 參照文獻(xiàn)[6]配制鐵限制性培養(yǎng)基，即含10μmol/L～150 μmol/L DIP 的 LB 培養(yǎng)基，確定 60 μmol/L DIP 的濃度恰好不影響ET-CL 菌株生長(zhǎng)，以該濃度進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。分別測(cè)定E.tarda3 個(gè)菌株在 LB 培養(yǎng)基和LB+DIP 培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況，繪制生長(zhǎng)曲線。

配制含終濃度為5 mmol/L FeSO4的M9 培養(yǎng)液，分別測(cè)定E.tarda3 個(gè)菌株在M9 培養(yǎng)基和M9+FeSO4培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況，繪制其生長(zhǎng)曲線。

1.7 ET-CLΔmenF對(duì)環(huán)境應(yīng)激抵抗力的測(cè)定 參照文獻(xiàn)[7]，分別檢測(cè)E.tarda3 個(gè)菌株在酸性應(yīng)激條件(pH3.5)和過(guò)氧化氫處理?xiàng)l件(10 mmol/L H2O2)下的生存能力。對(duì)應(yīng)激條件下的細(xì)菌培養(yǎng)物計(jì)數(shù)。試驗(yàn)重復(fù)3 次，試驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用Prism 5.0 軟件分析。

1.8 E T-CLΔmenF株在Raw264.7 細(xì)胞中存活能力的測(cè)定 參照文獻(xiàn)[8]，測(cè)定E.tarda3 個(gè)菌株在巨噬細(xì)胞系Raw264.7 內(nèi)的存活能力，計(jì)算各菌株增殖率(23 h/3 h)，即感染后23 h 與3 h 胞內(nèi)菌數(shù)比值。

1.9 ET-CLΔmenF株致病力的測(cè)定 參照文獻(xiàn)[9]分別接種E.tarda3 個(gè)菌株于TSB 液體培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng)，以 PBS 洗滌細(xì)菌 3 次并懸浮，調(diào)整細(xì)菌濃度。將 160 尾斑馬魚隨機(jī)分為 4組，包括 3 個(gè)實(shí)驗(yàn)組和一個(gè)對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組每組 50 尾，分別以1×104cfu、1×105cfu、1×106cfu、1×107cfu、1×108cfu 的劑量腹腔注射E.tarda3 個(gè)菌株，每一劑量 10 尾；對(duì)照組10 尾，接種等體積PBS。連續(xù)觀察2 周并統(tǒng)計(jì)死亡情況，根據(jù)Karber-Behrens 法計(jì)算細(xì)菌的半數(shù)致死量(LD50)，測(cè)定菌株對(duì)斑馬魚的致病力。

2 結(jié) 果

2.1 DmenF融合片段及pRE112-menF重組自殺載體的構(gòu)建 以E.tarda基因組為模板，分別利用P1/P2、P3/P4 引物擴(kuò)增menF基因上下游片段 F1 和F2，PCR 產(chǎn)物經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果顯示在750 bp 和1 000 bp 處出現(xiàn)特異性片段，與預(yù)期相符。將產(chǎn)物切膠回收，等比例混合作為模板，利用P1/P4 引物擴(kuò)增融合產(chǎn)物，結(jié)果顯示在1 800 bp處出現(xiàn)特異性片段，與預(yù)期相符，將融合片段產(chǎn)物回收克隆于pMD18-T 載體中，由北京生工生物工程有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明融合片段DmenF正確構(gòu)建(圖1)。進(jìn)一步將融合片段DmenF克隆于自殺載體pRE112 中，測(cè)序結(jié)果表明構(gòu)建了重組自殺載體pRE112-DmenF。

圖1 DmenF融合片段的構(gòu)建Fig.1 Amplification of DmenF gene from the genome of E.tarda by PCR

2.2E.tarda menF基因缺失株的鑒定 將重組自殺載體pRE112-DmenF通過(guò)結(jié)合轉(zhuǎn)移方式導(dǎo)入野生型ET-CL 菌株中，通過(guò)抗性篩選和蔗糖復(fù)篩獲得menF基因缺失株，利用特異性鑒定引物 P5/P6 對(duì)ΔmenF菌株進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示野生型菌株擴(kuò)增片段大小為1 900 bp，menF基因缺失菌株擴(kuò)增片段大小為 1 000 bp (圖2A)。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序，結(jié)果顯示menF基因被缺失；進(jìn)一步采用western blot 鑒定，結(jié)果顯示缺失菌株正確構(gòu)建(圖2B)。

圖2 E.tarda ET-CLΔmenF 基因缺失菌株鑒定Fig.2 Identification of ET-CLΔmenF mutant by PCR (A) and western blot (B)

2.3menF基因缺失對(duì)E.tarda生物學(xué)特性的影響E.tarda3 個(gè)菌株經(jīng)培養(yǎng)后分別測(cè)定菌液吸光度OD540nm值，繪制生長(zhǎng)曲線。結(jié)果顯示，在普通 LB培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)條件下，ET-CLΔmenF株的生長(zhǎng)速度略低于野生型菌株和回補(bǔ)菌株，但在M9 培養(yǎng)基中ET-CLΔmenF株生長(zhǎng)遲緩的特性更為明顯(圖3)。結(jié)果表明，menF基因的缺失降低了E.tarda的生長(zhǎng)速率。

圖3 E.tarda ET-CL 相關(guān)菌株生長(zhǎng)曲線測(cè)定Fig.3 Growth characteristics of ET-CL isogenic deletion strains

利用ATB 全自動(dòng)生化鑒定系統(tǒng)對(duì)E.tarda3 個(gè)菌株的生化反應(yīng)譜進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示：三者生化反應(yīng)譜無(wú)區(qū)別，表明menF基因缺失不影響E.tarda生化特性。

2.4menF基因缺失對(duì)E.tarda鐵饑餓耐受的影響向LB 培養(yǎng)基中添加適量濃度(該濃度為不影響野生型菌株生長(zhǎng)的最高濃度)鐵螯合劑 DIP，測(cè)定ET-CLΔmenF株在其中的生長(zhǎng)情況，結(jié)果顯示，在鐵限制性培養(yǎng)基中ET-CLΔmenF株的生長(zhǎng)明顯受到抑制；向 Minimal 培養(yǎng)基中添加過(guò)量 FeSO4，測(cè)定ET-CLΔmenF株的生長(zhǎng)情況，結(jié)果顯示，鐵元素的補(bǔ)充使 ET-CLΔmenF株在M9 中的生長(zhǎng)得到恢復(fù)，相比之下，實(shí)驗(yàn)?zāi)M的鐵饑餓和富鐵環(huán)境對(duì)E.tarda野生型菌株和回補(bǔ)菌株影響不大(圖4)。上述結(jié)果表明，MenF 參與E.tarda的鐵攝取利用過(guò)程。

圖4 鐵離子對(duì)ET-CL 相關(guān)菌株生長(zhǎng)特性的影響Fig.4 Growth characteristics of ET-CL isogenic deletion strains under iron starvation or excess

2.5menF基因缺失對(duì)E.tarda應(yīng)對(duì)環(huán)境應(yīng)激的影響 將E.tarda3 個(gè)菌株分別進(jìn)行酸性和氧化應(yīng)激處理，測(cè)定三者在應(yīng)激環(huán)境下的生存能力。結(jié)果顯示，與野生型菌株相比，menF基因缺失菌株在酸性和H2O2氧化條件下的生存能力明顯下降(圖5)。表明，MenF 蛋白在E.tarda耐受酸性應(yīng)激和氧化應(yīng)激中發(fā)揮作用。

圖5 環(huán)境應(yīng)激對(duì)ET-CL 相關(guān)菌株生長(zhǎng)的影響Fig.5 Effects of environmental stress on the growth of ET-CL related strains

2.6menF基因缺失對(duì)E.tarda胞內(nèi)生存的影響分別測(cè)定E.tarda3 個(gè)菌株在巨噬細(xì)胞 Raw264.7 內(nèi)的存活能力，結(jié)果顯示，ET-CLΔmenF株在巨噬細(xì)胞內(nèi)的增殖率相比野生型菌株降低0.6 倍(p＜0.01)(圖6)，表明MenF 缺失影響E.tarda的胞內(nèi)生存能力。

圖6 E.tarda ET-CL 相關(guān)菌株在巨噬細(xì)胞內(nèi)生存能力測(cè)定Fig.6 Intracellular viability assay of ET-CL related strains

2.7menF基因缺失對(duì)E.tarda致病力的影響E.tarda3 種菌株對(duì)斑馬魚的致病性試驗(yàn)顯示，對(duì)照組無(wú)死亡，統(tǒng)計(jì)實(shí)驗(yàn)組斑馬魚死亡情況，根據(jù)改良寇式法計(jì)算，E.tardaET-CL 野生菌株對(duì)斑馬魚的LD50為1.26×106cfu，ET-CLΔmenF菌株對(duì)斑馬魚的 LD50為1.43×107cfu，有 10 倍左右差異，回補(bǔ)菌株對(duì)斑馬魚的 LD50為 3.98×106cfu，表明menF基因缺失會(huì)引起E.tarda毒力下降。

3 討 論

MenF 是E.tarda所編碼的一種異分支酸合成酶，其能夠催化合成細(xì)菌生存關(guān)鍵分子- 異分支酸[10]。細(xì)菌通過(guò)自身合成和體外獲取兩種途徑獲得異分支酸，在宿主細(xì)胞內(nèi)，僅能通過(guò)自身合成途徑合成該物質(zhì)，一旦被阻斷，則細(xì)菌無(wú)法生存[11]。本研究對(duì)E.tarda menF基因進(jìn)行缺失，并進(jìn)一步評(píng)估其生物學(xué)特性發(fā)現(xiàn)，menF基因缺失并未影響E.tarda的生化特性，menF基因缺失株同野生型菌株具有完全相同的生化反應(yīng)譜，表明MenF 并未影響E.tarda對(duì)糖和氨基酸的利用。而生長(zhǎng)速度測(cè)定結(jié)果顯示，menF基因缺失后E.tarda在LB 中的生長(zhǎng)速度略有下降，而在M9 培養(yǎng)基中缺失菌株生長(zhǎng)明顯劣于野生型菌株。M9 培養(yǎng)基是僅由無(wú)機(jī)鹽和碳源配制的限制性培養(yǎng)基，背景清晰，menF基因缺失株在其中生長(zhǎng)受阻，證明培養(yǎng)基中缺乏menF基因缺失株菌株生長(zhǎng)所需原料。鐵是微生物生存所必須的元素，在宿主體內(nèi)鐵饑餓條件下，攝取足夠鐵是致病菌感染的先決條件，而在鐵攝取中發(fā)揮關(guān)鍵作用的是鐵載體[11]。有研究發(fā)現(xiàn)，在大腸桿菌、耶爾森菌和銅綠假單胞菌中分支酸合酶MenF 參與細(xì)菌鐵載體的合成，與細(xì)菌應(yīng)對(duì)鐵饑餓環(huán)境相關(guān)[12-13]。那么是否因?yàn)镸enF缺失影響鐵攝取進(jìn)而導(dǎo)致E.tarda生長(zhǎng)受阻呢？ 為回答這一問題，本研究利用特定濃度鐵螯合劑模擬鐵饑餓條件，證實(shí)了E.tarda menF基因缺失后應(yīng)對(duì)鐵饑餓的能力顯著下降。進(jìn)一步在M9 培養(yǎng)基中添加充足的鐵離子，發(fā)現(xiàn)menF基因缺失株的生長(zhǎng)得到部分恢復(fù)，證實(shí)了前面的猜想。E.tarda可以侵染機(jī)體多種細(xì)胞，并能夠在胞內(nèi)生存和增殖，這對(duì)于其感染致病十分關(guān)鍵，低pH 和活性氧是細(xì)胞清除胞內(nèi)病原的有效手段[14]，因此本研究利用體外模型模擬胞內(nèi)應(yīng)激環(huán)境以探索MenF 在遲緩愛德華菌胞內(nèi)存活中的作用，結(jié)果表明，menF基因缺失株應(yīng)對(duì)酸性和過(guò)氧化氫處理能力下降，揭示MenF 可能參與E.tarda胞內(nèi)存活。鐵攝取利用能力對(duì)于細(xì)菌胞內(nèi)生存十分關(guān)鍵，MenF 能夠影響E.tarda對(duì)鐵饑餓的耐受，也揭示該蛋白能夠影響E.tarda胞內(nèi)存活。本研究對(duì)比了menF基因缺失株和野生型菌株在鼠源巨噬細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)的生存能力，結(jié)果表明，menF基因缺失株夠顯著降低E.tarda的胞內(nèi)存活。莽草酸途徑對(duì)于微生物生存來(lái)說(shuō)至關(guān)重要，該途徑所涉及的某些酶類也被證實(shí)與細(xì)菌生長(zhǎng)、代謝以及致病性密切相關(guān)[4-5]，有研究在E.tarda中將莽草酸途徑關(guān)鍵酶aroA 缺失后，細(xì)菌毒力下降 10 萬(wàn)倍[15]。作為 莽草酸途徑的關(guān)鍵酶異分支酸合酶是否與細(xì)菌毒力相關(guān)尚未見研究報(bào)道，為此本研究進(jìn)一步利用經(jīng)典的斑馬魚模型來(lái)評(píng)估 ET-CLΔmenF的致病力，結(jié)果顯示，MenF 缺失能夠降低E.tarda毒力。

本研究成功構(gòu)建E.tarda menF基因缺失株，并對(duì)其生物學(xué)特性進(jìn)行研究，為E.tarda致病機(jī)制研究以及疫苗研制奠定基礎(chǔ)。