張 錚

(承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院藥學(xué)部，河北 承德 067000)

近年來(lái)，隨著飲食習(xí)慣和生活方式的改變，糖尿病的發(fā)病率明顯升高，且有逐步年輕化的趨勢(shì)[1]。糖尿病視網(wǎng)膜病變是糖尿病的常見(jiàn)微血管并發(fā)癥，主要是患者體內(nèi)長(zhǎng)期糖代謝紊亂，引起眼部微血管病變，嚴(yán)重時(shí)造成視力下降甚至失明，該病降低了患者的生活質(zhì)量，并對(duì)患者生命安全構(gòu)成重要威脅，已成為我國(guó)發(fā)病率最高致盲性眼病[2]。其典型病理表現(xiàn)可分為微循環(huán)障礙、視網(wǎng)膜-血管屏障被破壞和形成新生血管等[3]。如何選擇安全有效的早期預(yù)防及治療措施是研究的熱點(diǎn)，研究結(jié)果表明，視網(wǎng)膜微血管的增生是視網(wǎng)膜病變的標(biāo)志，其中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)是最強(qiáng)力的促血管生成因子[4]。藥理學(xué)研究結(jié)果證實(shí)，苦參堿具有很強(qiáng)的抑制細(xì)胞增生的作用，但目前尚未有關(guān)于苦參堿對(duì)微血管內(nèi)皮細(xì)胞增生的影響研究[5]。本研究探討了苦參堿對(duì)糖尿病視網(wǎng)膜病變大鼠視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞增生及VEGF表達(dá)的影響，分析其作用機(jī)制，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料

1.1 動(dòng)物

雄性SD健康大鼠90只(SPF級(jí))，年齡8周，體質(zhì)量201～250 g，購(gòu)自凱學(xué)生物科技(上海)有限公司，許可證號(hào)：NO.0251284。將所有大鼠分籠適應(yīng)性飼養(yǎng)，自由飲食飲水，環(huán)境溫度(22±1)℃，濕度(60±10)%，光照12 h/d，晝夜循環(huán)。

1.2 藥品與試劑

苦參堿(批號(hào)：Dksj20171117)購(gòu)于陜西昂盛生物試劑公司，劑量>99%；鏈脲佐菌素(規(guī)格：58 mg/kg，批號(hào)：S030-1)購(gòu)于華中海威(北京)基因科技有限公司；戊巴比妥鈉購(gòu)于Biotopped公司；磷酸鹽緩沖液(PBS)購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；二乙烯四乙酸二鈉(EDTA)和胰酶購(gòu)于AMRESCO公司；超氧化物歧化酶1(SOD1)、丙二醛(MDA)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細(xì)胞介素1β(IL-1β)、白細(xì)胞介素6(IL-6)和C反應(yīng)蛋白(CRP)試劑盒購(gòu)于上海滬震實(shí)業(yè)有限公司。

1.3 儀器

光學(xué)顯微鏡(洛陽(yáng)惠爾納米科技有限公司)；組織搗碎勻漿機(jī)(天津博天勝達(dá)科技發(fā)展有限公司)。

2 方法

2.1 造模與分組

從適應(yīng)性飼養(yǎng)后的90只大鼠中，按照隨機(jī)數(shù)字表法抽取15只作為正常組，給予正常飲食飲水飼養(yǎng)。剩余的75只大鼠進(jìn)行造模，先禁食10 h，然后給予鏈脲佐菌素50 mg/kg，腹腔注射；3 d后，抽取大鼠尾靜脈血，測(cè)定血糖>16.7 mmol/L和尿糖3+～4+，即為造模成功，為糖尿病大鼠。繼續(xù)飼養(yǎng)4周，將大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組，對(duì)照組，低、中及高劑量組，每組15只。對(duì)照組大鼠給予羥苯磺酸鈣30 mg/(kg·d)，稀釋于5 ml蒸餾水中，灌胃；低、中及高劑量組大鼠分別給予苦參堿30、60及90 mg/(kg·d)，稀釋于5 ml蒸餾水中，灌胃；正常組和模型組大神給予等量的蒸餾水。所有大鼠連續(xù)給藥20周。

2.2 觀察指標(biāo)

2.2.1 大鼠血清相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)：抽取大鼠內(nèi)眥靜脈血2 ml，離心處理，取上清液即為血清，使用檢測(cè)試劑盒，按照說(shuō)明書(shū)操作，檢測(cè)SOD1、MDA、TNF-α、IL-1β、IL-6及CRP含量。

2.2.2 病理切片的制作：將大鼠處死，摘取左眼眼球，置于冰面上，去除角膜、虹膜等，然后固定于固定液內(nèi)48 h，取2 mm×2 mm的視網(wǎng)膜組織，做石蠟切片，常規(guī)蘇木精-伊紅(HE)染色，鏡下觀察視網(wǎng)膜細(xì)胞。

2.2.3 細(xì)胞凋亡情況：將各組大鼠右眼視網(wǎng)膜細(xì)胞做過(guò)碘酸雪夫(PAS)染色切片，采用光學(xué)顯微鏡觀察(200倍)，自視乳頭向前，每張切片隨機(jī)選取4個(gè)視野，將總數(shù)除以50，計(jì)數(shù)每個(gè)視野內(nèi)皮細(xì)胞凋亡數(shù)，取平均值。細(xì)胞凋亡判斷標(biāo)準(zhǔn)為細(xì)胞核破碎、濃縮，細(xì)胞變小，早期細(xì)胞膜完整，晚期有凋亡小體。

2.2.4 VEGF、ANG1蛋白的表達(dá)檢測(cè)：采用Western Bloting 法，用蛋白提取試劑盒提取視網(wǎng)膜組織標(biāo)本，蛋白劑量由BCA法檢測(cè)，檢測(cè)VEGF、ANG1蛋白的含量。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 六組大鼠視網(wǎng)膜組織病理切片觀察

病理切片顯示，正常組大鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞膜完整，結(jié)構(gòu)清晰，毛細(xì)血管腔壁完整；模型組大鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞水腫，組織結(jié)構(gòu)紊亂，毛細(xì)血管腔內(nèi)不規(guī)則擴(kuò)張，內(nèi)皮細(xì)胞增生，可見(jiàn)紅細(xì)胞，周細(xì)胞水腫；對(duì)照組大鼠視網(wǎng)膜組織病變較模型組改善，但可見(jiàn)擴(kuò)張的微血管；低、中及高劑量組大鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞水腫癥狀好于對(duì)照組，并隨著劑量的升高，細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整性提高，擴(kuò)張的微血管更少，見(jiàn)圖1。

A.正常組；B.模型組；C.對(duì)照組；D.低劑量組；E.中劑量組；F.高劑量組A. normal group; B. model group; C. control group; D. low-dose group; E. medium-dose group; F. high-dose group圖1 各組大鼠視網(wǎng)膜組織病理切片F(xiàn)ig 1 Pathological sections of retinal tissue of each group

3.2 六組大鼠視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡情況比較

低、中及高劑量組大鼠視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡數(shù)明顯高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且隨著苦參堿劑量的升高，凋亡數(shù)增多，見(jiàn)表1。

表1 六組大鼠視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡情況比較Tab 1 Comparison of apoptosis of retinal microvascular endothelial cells among six groups

注：與模型組比較，*P<0.05，與對(duì)照組比較，#P<0.05

Note: vs. model group,*P<0.05; vs. control group,#P<0.05

3.3 六組大鼠血清SOD1、MDA及CRP水平比較

低、中及高劑量組大鼠SOD1水平明顯高于模型組和對(duì)照組，MDA、CRP水平明顯低于模型組和對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且隨著苦參堿劑量的升高，SOD1水平升高，MDA、CRP水平降低，見(jiàn)表2。

表2 六組大鼠血清SOD1、MDA及CRP水平比較Tab 2 Comparison of serum SOD1, MDA and CRP levels among six groups

注：與模型組比較，*P<0.05，與對(duì)照組比較，#P<0.05

Note: vs. model group,*P<0.05; vs. control group,#P<0.05.

3.4 六組大鼠血清TNF-α、IL-1β及IL-6水平比較

低、中及高劑量組大鼠TNF-α、IL-1β及IL-6水平明顯低于模型組和對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且隨著苦參堿劑量的升高，TNF-α、IL-1β及IL-6水平降低，見(jiàn)表3。

表3 六組大鼠血清TNF-α、IL-1β及IL-6水平比較Tab 3 Comparison of serum TNF-α, IL-1β and IL-6 levels among six groups ng/L)

注：與模型組比較，*P<0.05，與對(duì)照組比較，#P<0.05

Note: vs. model group,*P<0.05; vs. control group,#P<0.05

3.5 六組大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)VEGF、ANG1蛋白表達(dá)的比較

低、中及高劑量組大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)VEGF、ANG1蛋白含量明顯低于模型組和對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且隨著苦參堿劑量的升高，視網(wǎng)膜內(nèi)VEGF、ANG1蛋白含量降低，見(jiàn)表4。

表4 六組大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)VEGF、ANG1蛋白表達(dá)比較Tab 4 Comparison of VEGF and ANG1 protein expression

注：與模型組比較，*P<0.05，與對(duì)照組比較，#P<0.05

Note: vs. model group,*P<0.05; vs. control group,#P<0.05

4 討論

糖尿病視網(wǎng)膜病變的主要表現(xiàn)是內(nèi)皮細(xì)胞增生引起的微血管擴(kuò)張[6]。其中VEGF和ANG是最強(qiáng)的促血管生成因子，可以特異性地作用于內(nèi)皮細(xì)胞，刺激細(xì)胞的有絲分裂[7]，且能夠增加血管通透性，促進(jìn)毛細(xì)血管腔的形成?？鄥A是苦參的提取物，已有研究結(jié)果證實(shí)其具有抗心律失常、抗肝纖維化和免疫調(diào)節(jié)的作用[8]。本研究結(jié)果也證實(shí)，苦參堿各劑量組大鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞損傷情況均好于對(duì)照組，并隨著劑量的升高，細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整性提高，擴(kuò)張的微血管更少，說(shuō)明苦參堿能夠明顯改善視網(wǎng)膜損傷，減少微血管的生成。

在治療糖尿病視網(wǎng)膜病變的過(guò)程中，抑制新生血管的形成是改善病情的關(guān)鍵[9]。本研究中，低、中及高劑量組大鼠視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡數(shù)明顯高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且隨著苦參堿劑量的升高，凋亡數(shù)增多。說(shuō)明苦參堿能夠明顯抑制微血管內(nèi)皮細(xì)胞的增生，效果優(yōu)于羥苯磺酸鈣。低、中及高劑量組大鼠血清SOD1水平明顯高于模型組和對(duì)照組，MDA、CRP、TNF-α、IL-1β及IL-6水平明顯低于模型組和對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且隨著苦參堿劑量的升高，SOD1水平升高，MDA、CRP、TNF-α、IL-1β及IL-6水平降低。說(shuō)明苦參堿具有抗炎和抗氧化作用，可以保護(hù)受損的視網(wǎng)膜細(xì)胞。目前，對(duì)糖尿病視網(wǎng)膜病變發(fā)生機(jī)制的研究主要集中于氧化及炎癥反應(yīng)和內(nèi)皮細(xì)胞的增生2個(gè)方面[10-11]。高糖可以破壞內(nèi)皮細(xì)胞的抗氧化防御系統(tǒng)，抑制SOD的表達(dá)，增加線粒體膜的通透性，從而損傷線粒體DNA，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其中MDA是氧化應(yīng)激反應(yīng)的產(chǎn)物[12]。視網(wǎng)膜細(xì)胞的損傷與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，TNF-α可誘導(dǎo)視網(wǎng)膜間充質(zhì)細(xì)胞分泌細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，誘導(dǎo)血管活性物質(zhì)表達(dá)，導(dǎo)致毛細(xì)血管閉塞[13]；IL-1β除能參與炎癥反應(yīng)外，還參與了多種與視網(wǎng)膜損傷發(fā)展相關(guān)的細(xì)胞因子合成和分泌，如長(zhǎng)期得不到糾正，由IL-1β引起的炎癥反應(yīng)及微血管病變將導(dǎo)致視網(wǎng)膜病變發(fā)生；IL-6也具有上調(diào)CRP表達(dá)的作用，CRP水平升高會(huì)損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞[14]。 本研究中，低、中及高劑量組大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)VEGF、ANG1蛋白含量明顯低于模型組和對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且隨著苦參堿劑量的升高，視網(wǎng)膜內(nèi)VEGF、ANG1蛋白含量降低。提示苦參堿可以抑制大鼠VEGF、ANG1的生成，與于靜等[2]的研究結(jié)果一致，說(shuō)明苦參堿改善大鼠視網(wǎng)膜病變是通過(guò)下調(diào)VEGF、ANG1的表達(dá)，抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增生來(lái)發(fā)揮的。VEGF不僅可以增加微血管內(nèi)皮細(xì)胞的通透性，還可以調(diào)控相關(guān)炎性因子，與炎性因子互相影響，造成視網(wǎng)膜細(xì)胞的損傷，引起水腫，并促進(jìn)微血管的形成[15]。但苦參堿是如何調(diào)控VEGF、ANG1的表達(dá)，其中何種信號(hào)通路在發(fā)揮作用，還需要進(jìn)一步試驗(yàn)探討。

綜上所述，苦參堿可改善糖尿病大鼠的視網(wǎng)膜損傷，抑制視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞的增生；其是通過(guò)調(diào)節(jié)VEGF、ANG1的表達(dá)，提高SOD1的表達(dá)，減少M(fèi)DA、CRP、TNF-α、IL-1β及IL-6含量來(lái)發(fā)揮改善病情的作用。