王苗苗，周向睿，梁國(guó)玲，趙桂琴

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 草業(yè)學(xué)院/草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/甘肅省草業(yè)工程實(shí)驗(yàn)室/中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，甘肅 蘭州 730070； 2.青海省青藏高原優(yōu)良牧草種質(zhì)資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海 西寧 810016)

土壤中過多的鹽分積累會(huì)造成植物膜結(jié)構(gòu)的完整性與穩(wěn)定性下降，透性增加，離子吸收的平衡被破壞，生理生化代謝紊亂，生長(zhǎng)受抑，同時(shí)還會(huì)使植物產(chǎn)生單鹽毒害作用[1]。植物種子萌發(fā)期對(duì)鹽脅迫比較敏感，種子萌發(fā)、生長(zhǎng)發(fā)育都會(huì)受到高鹽分的抑制[2]。研究證實(shí)鹽脅迫對(duì)小麥，玉米以及苜蓿等種子表現(xiàn)為高濃度的鹽分對(duì)其生長(zhǎng)有抑制作用，低濃度的鹽分對(duì)其生長(zhǎng)影響較小，并具有一定的促進(jìn)作用[3-4]。有研究報(bào)道，種子萌發(fā)期是植物能否在鹽脅迫下完成生育周期最為關(guān)鍵的時(shí)期，對(duì)植物后期的生長(zhǎng)具有一定的影響[5]。

燕麥?zhǔn)呛瘫究?Gramineae)燕麥屬(Avena)一年生草本植物，屬于長(zhǎng)日照植物，分皮燕麥和裸燕麥兩大類[6]。國(guó)外栽培以皮燕麥為主，而裸燕麥主要作為中國(guó)高寒區(qū)域糧飼兼用作物。燕麥作為一種優(yōu)良的一年生飼用作物，具有耐寒、耐脊薄、耐適度鹽堿的特點(diǎn)[7-8]。由于燕麥具有較高的抗鹽堿能力，被廣泛認(rèn)為是鹽堿地改良的替代作物。燕麥耐鹽性研究從2000年以來引起人們的高度重視，對(duì)鹽脅迫下燕麥的適應(yīng)性研究發(fā)現(xiàn)，隨著鹽脅迫程度的增加，燕麥的株高、葉面積明顯受到抑制，脅迫嚴(yán)重時(shí)會(huì)枯萎[9]。研究表明[10]，不同濃度鹽處理對(duì)燕麥根長(zhǎng)和芽長(zhǎng)的影響不同，低濃度可以促進(jìn)燕麥根系和幼苗的生長(zhǎng)；高濃度抑制根系的伸長(zhǎng)和芽的生長(zhǎng)，而且，燕麥的耐鹽性由于品種的不同存在很大差異。采用人工模擬鹽脅迫的方法，對(duì)12個(gè)不同燕麥種質(zhì)材料進(jìn)行萌發(fā)期評(píng)價(jià)和綜合比較，篩選出高濃度下比較耐鹽的材料，為后期深入的研究其抗逆分子機(jī)制、挖掘耐鹽基因以及燕麥育種提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試燕麥種質(zhì)材料共12份(分別為440、474、473、白燕7號(hào)、876、青永久195、青永久30、424、479、110、126、初島)，供試材料由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院提供。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 試驗(yàn)設(shè)4個(gè)NaCl濃度梯度處理，分別為0%(對(duì)照)、0.3%、0.6%、0.9%，3次重復(fù)。采用發(fā)芽盒紙上發(fā)芽法，每個(gè)發(fā)芽盒加入10 mL NaCl鹽溶液，放入50粒飽滿度一致的燕麥種子，然后稱其重量并記錄，鹽處理后通過稱重法補(bǔ)充每天蒸發(fā)的水分，使發(fā)芽盒中鹽濃度保持不變。從12份燕麥種質(zhì)材料中篩選出5份耐鹽性較好的材料，用Hoagland營(yíng)養(yǎng)液進(jìn)行幼苗培養(yǎng)，培養(yǎng)3周后加入0.9%鹽溶液，幼苗在鹽溶液中培養(yǎng)周后進(jìn)行根、葉以及生理指標(biāo)的測(cè)定。

1.2.2 萌發(fā)指標(biāo)測(cè)定與方法

(1)發(fā)芽勢(shì)：加鹽后第5 d，統(tǒng)計(jì)每個(gè)培養(yǎng)皿中發(fā)芽的種子，計(jì)算各材料的發(fā)芽勢(shì)[3](每皿正常發(fā)芽的種子數(shù)供試種子的百分比作為該培養(yǎng)皿的發(fā)芽勢(shì))。

相對(duì)發(fā)芽勢(shì)=鹽處理材料的發(fā)芽勢(shì)/對(duì)照材料的發(fā)芽勢(shì)×100%[3]

(2)發(fā)芽率：加鹽后第10 d，統(tǒng)計(jì)每個(gè)培養(yǎng)皿中發(fā)芽的種子，計(jì)算各材料的發(fā)芽率[3](每皿正常發(fā)芽種子數(shù)占供試種子數(shù)的百分率作為該皿的發(fā)芽率)。

相對(duì)發(fā)芽率=鹽處理材料的發(fā)芽率/對(duì)照材料的發(fā)芽率×100%[3]

1.2.3 生長(zhǎng)指標(biāo)測(cè)定

(1)根長(zhǎng)：加鹽后第10 d，用直尺測(cè)定每株苗從種子胚到最長(zhǎng)根根尖的長(zhǎng)度。

相對(duì)根長(zhǎng)=鹽處理植株的根長(zhǎng)/對(duì)照植株的根長(zhǎng)×100%[5]

(2)芽長(zhǎng)：加鹽后第10 d，用直尺測(cè)定每棵苗從種子胚到最長(zhǎng)葉葉尖的長(zhǎng)度。

相對(duì)芽長(zhǎng)=鹽處理植株的芽長(zhǎng)/對(duì)照植株的芽長(zhǎng)×100%[5]

(3)根、葉鮮重：隨機(jī)選取5株幼苗，清水洗凈，將其分成地上和地下兩部分,測(cè)定其根、葉鮮重。

1.2.4 生理指標(biāo)測(cè)定

(1) 葉綠素含量：采用丙酮比色法[11]。按公式計(jì)算葉綠素含量

葉綠素含量(mg/g FW)=(8.02×D663 nm+20.20×D645 nm)×V/(1 000×W)

式中：V為丙酮提取液的體積(mL)；W為所取樣品的鮮重(g)。

(2) 水分利用效率：在光強(qiáng)為1 000±50 μmol/(m2·s) 的鹵素?zé)粝?，于上?∶00～11∶30 用LI 6400 便攜式光合儀(LI2COR,USA)測(cè)定葉片的凈光合速率(Pn)和蒸騰速率(E)，水分利用效率=Pn/E。

1.3 耐鹽性評(píng)價(jià)

評(píng)價(jià)方法采用五級(jí)評(píng)分法[12]，即將各項(xiàng)指標(biāo)的測(cè)定值經(jīng)過換算進(jìn)行定量表示，根據(jù)各指標(biāo)的變異系數(shù)確定各指標(biāo)參與綜合評(píng)價(jià)的權(quán)重系數(shù)矩陣，經(jīng)過權(quán)重分析，進(jìn)行抗鹽堿能力綜合評(píng)價(jià)[13]。根據(jù)綜合評(píng)價(jià)值的大小，確定材料的抗鹽堿能力強(qiáng)弱，此方法可以消除各性狀因數(shù)值大小和變化幅度的不同而產(chǎn)生的差異[14]。其換算公式：

(1)

(2)

式中：Hn：為各指標(biāo)測(cè)定的最大值；HL：為各指標(biāo)測(cè)定的最小值；H：為各指標(biāo)測(cè)定的任意值；D：得分極差；E：應(yīng)得分。

先將各個(gè)指標(biāo)測(cè)定的最小值定為1分，求出D值代入公式(2)求出任意測(cè)定值的應(yīng)得分。

根據(jù)各指標(biāo)的變異系數(shù)確定各指標(biāo)參與綜合評(píng)價(jià)的權(quán)重系數(shù)。

任一指標(biāo)的權(quán)重系數(shù)=任一指標(biāo)的變異系數(shù)/各指標(biāo)變異系數(shù)之和。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)通過Microsoft Excel 2010，SPSS 22.0數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行整理、方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽脅迫對(duì)燕麥發(fā)芽勢(shì)的影響

在不同的鹽濃度處理下各材料間的發(fā)芽勢(shì)差異顯著(P<0.05)(表1)，與CK相比，876，110和424材料在0.3%鹽處理下的發(fā)芽勢(shì)高；而440、474、876、青永久195、青永久30、424、479各個(gè)材料在0.6%的鹽濃度下發(fā)芽勢(shì)高，與對(duì)照相比，474和473兩個(gè)材料在0.9%鹽濃度下發(fā)芽勢(shì)沒有明顯變化。在各鹽濃度處理下材料青永久195和白燕7號(hào)的發(fā)芽勢(shì)都較高，為高發(fā)芽勢(shì)材料；110和424的發(fā)芽勢(shì)都較低，為低發(fā)芽勢(shì)材料。

在0.3%鹽濃度下材料相對(duì)發(fā)芽勢(shì)為69.31%～199.85%，在0.6%和0.9%的鹽濃度處理下，材料的相對(duì)發(fā)芽勢(shì)分別為77.75%～249.93%、46.70%～149.93%，說明不同的燕麥材料對(duì)鹽脅迫的適應(yīng)性存在差異(表2)。

2.2 鹽脅迫對(duì)燕麥發(fā)芽率的影響

鹽脅迫處理后第10 d隨著鹽濃度的增加，大部分材料的發(fā)芽率呈下降趨勢(shì)，但在低鹽濃度下，部分材料的發(fā)芽率有增大趨勢(shì)(表3)。其中，474、473、青永久30、479、126、初島在0.3%鹽濃度的處理下，其發(fā)芽率顯著高于對(duì)照；而440、青永久30、474、479在0.6%鹽濃度處理下，其發(fā)芽率明顯高于對(duì)照，在不同的鹽處理下，青永久195整體發(fā)芽率都較高，為耐鹽材料；110、424在各濃度下整體發(fā)芽率較低，為低發(fā)芽率材料。

表1 12份燕麥種質(zhì)在不同鹽脅迫下的發(fā)芽勢(shì)(5 d)

注：同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，下同

表2 12份燕麥種質(zhì)在不同鹽脅迫下的相對(duì)發(fā)芽勢(shì)

在0.3%鹽濃度水平下，材料的相對(duì)發(fā)芽率變化為74.51%～144.09%，在0.6%、0.9%鹽濃度處理下，相對(duì)發(fā)芽率分別為76.82%～149.17%、75.51%～147.47%，說明不同的材料對(duì)鹽脅迫的耐受能力差異很大，其中474，876和青永久195的相對(duì)發(fā)芽率隨鹽濃度的增加而增加，424，110和126、初島隨鹽濃度的增加相對(duì)發(fā)芽率有明顯下降，其他材料均有不同程度的下降(表4)。

表3 12份燕麥種質(zhì)在不同鹽脅迫下的發(fā)芽率(10 d)

表4 12份燕麥種質(zhì)在不同鹽脅迫下的相對(duì)發(fā)芽率

2.3 鹽脅迫對(duì)燕麥種質(zhì)相對(duì)根長(zhǎng)的影響

鹽脅迫后第10 d不同燕麥種質(zhì)材料間的相對(duì)根長(zhǎng)與對(duì)照相比，隨鹽濃度的增大有變短的趨勢(shì)(表5)，在0.3%和0.6%鹽濃度水平下，相對(duì)根長(zhǎng)變化分別為46.01%～134.46%和36.19%～114.28%，部分材料的相對(duì)根長(zhǎng)增加，說明低鹽濃度對(duì)部分燕麥萌發(fā)期根長(zhǎng)有一定的促進(jìn)作用。在0.9%鹽濃度下，相對(duì)根長(zhǎng)變化為18.52%～96.00%，其中876、青永久195、初島與其他各材料之間存在較明顯的差異。材料473隨鹽濃度的增加，根長(zhǎng)受抑制作用較小。材料474、424隨鹽濃度的增加根長(zhǎng)受到很大抑制作用。

2.4 鹽脅迫對(duì)燕麥種質(zhì)相對(duì)芽長(zhǎng)的影響

鹽脅迫后第10 d不同燕麥種質(zhì)之間的相對(duì)芽長(zhǎng)隨鹽濃度的增加較對(duì)照有明顯變短的趨勢(shì)，但在低鹽濃度下，部分燕麥種質(zhì)材料的相對(duì)芽長(zhǎng)增加，說明較低鹽濃度處理對(duì)燕麥萌發(fā)期芽長(zhǎng)的生長(zhǎng)有促進(jìn)作用。在0.3%、0.6%、0.9%鹽濃度脅迫下，燕麥種質(zhì)的相對(duì)芽長(zhǎng)分別為76.09%～126.7%，56.54%～130.13%和48.23%～96.77%，說明不同的材料對(duì)鹽脅迫的耐受能力不同，較高的鹽濃度對(duì)材料萌發(fā)期芽長(zhǎng)的生長(zhǎng)有抑制作用。其中440、424、126隨鹽濃度增加明顯下降，說明耐鹽性差；白燕7號(hào)、479、初島隨鹽濃度的增加沒有明顯變化，說明耐鹽性好，其他材料隨鹽濃度的增加都有不同程度的下降(表6)。

表5 12份燕麥種質(zhì)在不同鹽脅迫下的相對(duì)根長(zhǎng)

表6 12份燕麥種質(zhì)在不同鹽脅迫下的相對(duì)芽長(zhǎng)

2.5 12個(gè)燕麥種質(zhì)耐鹽性綜合評(píng)價(jià)

采用五級(jí)評(píng)分法在0.6%鹽濃度下進(jìn)行燕麥種質(zhì)種質(zhì)耐鹽性的綜合評(píng)價(jià)，耐鹽性最好的材料是青永久195、青永久30和126。耐鹽性最差的材料是110(表7)。而在0.9%的鹽濃度下，耐鹽性好的為：青永久195、青永久30和白燕7號(hào)(表7)。綜合0.6%和0.9%鹽處理，最終選出耐鹽性較好的材料為青永久195、青永久30、白燕7號(hào)、126、474(表8)。

表7 12份燕麥種質(zhì)在0.6%和0.9%鹽處理下的得分及變異系數(shù)

表8 12份燕麥種質(zhì)在0.6%和0.9%鹽水平下的綜合評(píng)價(jià)值

2.6 鹽脅迫對(duì)葉綠素含量、根和葉鮮重及水分利用效率的影響

根據(jù)評(píng)價(jià)結(jié)果選取耐鹽性前5名的燕麥種質(zhì)分別測(cè)定了0.9%鹽濃度下其葉綠素含量，根葉鮮重及水分利用效率。結(jié)果表明，在鹽脅迫下，葉綠素含量最高的是白燕7號(hào)，為22.1 mg/g，最低的是474，為18.26 mg/g；與對(duì)照相比，青永久30、126、青永久195燕麥種質(zhì)的葉綠素含量降低，分別為10.29%、6.92%、20.67%，而474、白燕7號(hào)兩個(gè)材料升高，分別為13.9%、16.05%。在鹽脅迫下，青永久195根和葉的鮮重最高，與其他4份材料相比差異顯著；與對(duì)照相比，5份燕麥材料的根葉鮮重均有所降低。在鹽脅迫下，水分利用效率最高的是青永久195，最小的是青永久30；與對(duì)照相比青永久30、474、青永久195的水分利用效率有所下降，分別為6.06%，3.39%和0.87%，而白燕7號(hào)和126兩個(gè)燕麥種質(zhì)都提高，分別為7.23%、11.3%(表4)。綜合以上結(jié)果，青永久195的耐鹽性在試驗(yàn)中表現(xiàn)最強(qiáng)。

表9 5份燕麥種質(zhì)材料在0.9% NaCl下的葉綠素含量、根葉鮮重及水分利用效率

3 討論

種子萌發(fā)需要一定的離子濃度，離子的滲入可以激活代謝過程中的某些酶，能更加充分的合成發(fā)芽所需物質(zhì),因此，使其發(fā)芽更加迅速,超過一定濃度范圍后，隨著鹽濃度的增加，鹽分會(huì)抑制燕麥種子萌發(fā)、幼苗的生長(zhǎng)[15-16]。當(dāng)0.3%鹽濃度下，燕麥的發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率、相對(duì)根長(zhǎng)和相對(duì)芽長(zhǎng)較對(duì)照好，隨著濃度的增加，燕麥的發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)明顯低于對(duì)照，這與前人對(duì)燕麥鹽脅迫的研究一致[15]。說明低濃度的NaCl能促進(jìn)某些植物種子萌發(fā)，而高濃度時(shí)抑制，這種現(xiàn)象與低鹽促進(jìn)細(xì)胞膜滲透調(diào)節(jié)有關(guān)，在高濃度NaCl脅迫下，由于溶液中鹽分過多，水勢(shì)降低，種子幼芽吸水困難，使植物細(xì)胞造成滲透脅迫,使種子萌發(fā)過程中生理缺水，因而抑制種子的萌發(fā)[17]。試驗(yàn)中青永久195和474材料在0.6%和0.9%鹽濃度下的相對(duì)發(fā)芽率較對(duì)照沒有明顯變化,這說明中高濃度鹽脅迫可能不會(huì)影響燕麥種質(zhì)細(xì)胞膜的滲透平衡，也就是在萌發(fā)期較高濃度NaCl下可以繼續(xù)維持燕麥種質(zhì)的滲透平衡，從而減緩高鹽脅迫對(duì)燕麥萌發(fā)期的傷害。燕麥作為耐鹽性作物，生長(zhǎng)發(fā)育需要適量的離子濃度參與各種生理代謝以保持離子平衡[18]。試驗(yàn)中，在0.6%鹽水平下對(duì)部分燕麥的萌發(fā)和生長(zhǎng)抑制的程度并不大，在0.9%鹽水平下，少許材料的燕麥萌發(fā)和生長(zhǎng)沒有受到明顯抑制，表現(xiàn)出了極強(qiáng)的耐鹽性。

葉綠素是植物光合作用必不可少的重要物質(zhì),葉綠素的變化直接影響植物體內(nèi)有機(jī)物質(zhì)的合成和自身生長(zhǎng)。研究報(bào)道植物遭受鹽脅迫后葉綠素含量會(huì)減少，而試驗(yàn)中青永久195，白燕7號(hào)和126的葉綠素含量有所升高，這與時(shí)麗冉[11]在小麥雜交品種衡9966苗期耐鹽性分析中相同，說明了在鹽脅迫下燕麥種質(zhì)材料通過增加葉綠素含量來緩解鹽脅迫造成的危害。鹽脅迫下植物葉綠素含量升高的現(xiàn)象在小麥中也有所報(bào)道[20-21],這與鹽脅迫處理時(shí)間有關(guān)。水分利用效率由凈光合速率和蒸騰速率共同決定，試驗(yàn)中白燕7號(hào)和126兩個(gè)材料水分利用效率提高，說明材料的耐鹽性好且水分利用效率的提高有利于干物質(zhì)積累，限制Na+進(jìn)入葉片，從而相對(duì)減少了毒害離子( Na+) 的吸收[21]。因此，在鹽脅迫下，燕麥葉片水分利用效率提高是一種適應(yīng)性反應(yīng)，既屬于非鹽生植物的避Na+機(jī)制，也是植物適應(yīng)滲透脅迫的重要機(jī)制之一。

植物在鹽脅迫下表現(xiàn)出的耐鹽性是一個(gè)復(fù)雜的過程，其耐鹽能力的大小是多種因素影響的綜合表現(xiàn),如果只根據(jù)單一的指標(biāo)來評(píng)價(jià)植物的耐鹽性高低,不能客觀的反映植物的真實(shí)耐鹽性[22]。植物的抗逆性主要由植物本身的基因決定，而燕麥種質(zhì)材料的耐鹽性也因材料會(huì)表現(xiàn)出差異[23]，篩選出耐鹽性好的材料，以便對(duì)燕麥的耐鹽機(jī)理進(jìn)一步的研究。燕麥萌發(fā)期的耐鹽性受多種因素的影響，不能一概而論，耐鹽性的評(píng)價(jià)要進(jìn)行綜合考慮，試驗(yàn)采用五級(jí)評(píng)分法，綜合不同材料在0.9%鹽脅迫下其發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率、芽長(zhǎng)和根長(zhǎng)指標(biāo)的測(cè)定值，進(jìn)行定量表示，計(jì)算其變異系數(shù)和權(quán)重分析，最后得到12個(gè)燕麥材料的耐鹽性排名。并對(duì)耐鹽性好的材料進(jìn)行了高鹽脅迫處理，進(jìn)一步驗(yàn)證耐鹽性。

4 結(jié)論

(1) 通過試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，在低鹽濃度下，部分供試材料的發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率、相對(duì)根長(zhǎng)、相對(duì)芽長(zhǎng)較對(duì)照有明顯增加的趨勢(shì)，說明低濃度鹽脅迫對(duì)燕麥種質(zhì)萌發(fā)和生長(zhǎng)有一定的促進(jìn)作用。但隨鹽濃度的增加，特別是在0.9%鹽濃度下，440、126、青永久30、初島四份材料的發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率明顯下降，12份材料的相對(duì)芽長(zhǎng)和相對(duì)根長(zhǎng)均下降，說明高濃度鹽脅迫對(duì)燕麥種質(zhì)萌發(fā)和生長(zhǎng)有明顯的抑制作用。

(2) 在0.9%鹽處理下，供試材料青永久195的水分利用效率、根和葉的鮮重最高，與其它4份材料相比差異顯著。因此，通過五級(jí)評(píng)分法和生理指標(biāo)的測(cè)定，篩選出青永久195耐鹽性比較強(qiáng)，可以作為進(jìn)一步挖掘耐鹽基因的燕麥種質(zhì)。