徐小雁，蘇 越，郭寅龍

(1.上海中醫(yī)藥大學(xué) 中醫(yī)方證與系統(tǒng)生物學(xué)研究中心，上海 201203；2.中國科學(xué)院 上海有機化學(xué)研究所 上海有機質(zhì)譜中心，上海 200032)

隨著中藥材消費的增加，中藥材的品質(zhì)日益受到人們的關(guān)注[1]。霉變是引起中藥材品質(zhì)變差的重要原因之一。一方面，霉變會引起中藥材有效成分的降解，另一方面，霉菌會產(chǎn)生許多對人體有害的霉菌毒素，因此快速準(zhǔn)確地確定藥材是否被霉菌污染對于藥材質(zhì)量控制具有非常重要的意義[2]。傳統(tǒng)的鑒定方法是微生物計數(shù)法，該過程需對霉菌進行稀釋培養(yǎng)，耗時耗力[3]。目前，很多研究通過酶聯(lián)免疫吸附法[4]、熒光分析法[5]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(LC-MS)[6-7]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS)[8-9]等對中藥材中的霉菌毒素進行測定，從而鑒定中藥材被霉菌污染的情況。上述方法的靈敏度較高，能夠有效檢測各種霉菌毒素，其中LC-MS法已成為目前霉菌毒素分析的標(biāo)準(zhǔn)方法。但這些方法受樣品基體的影響較大，通常需要較繁瑣的樣品前處理過程，而且它們僅限于檢測其中的產(chǎn)毒霉菌，具有局限性。因此需要開發(fā)一種新的方法對中藥材霉菌污染狀況進行快速鑒定[10]。

甾醇是一類以環(huán)戊烷多氫菲為基本結(jié)構(gòu)的甾族化合物，其廣泛存在于細菌、真菌以及動植物中，根據(jù)來源可分為植物甾醇、動物甾醇以及菌類甾醇等。由于甾醇結(jié)構(gòu)的多樣性，使它們具備許多生物學(xué)功能，例如，β-谷甾醇和麥角甾醇分別是植物和真菌細胞膜的重要組分，在細胞信號調(diào)節(jié)方面具有非常重要的作用[11]。中藥材中的甾醇一般均為植物甾醇，而受到霉菌污染后，由于微生物的存在會出現(xiàn)動物來源以及菌類來源的甾醇，所以可通過確定中藥材中甾醇的種類來鑒定其是否受到霉菌污染。目前甾醇類化合物的分析主要采用LC-MS及GC-MS法[12-14]，但樣品前處理較復(fù)雜，需要分離純化過程，不能滿足高通量篩選的需要。此外，由于甾醇類化合物的質(zhì)子親和力較低，酸性較弱，質(zhì)譜信號易被抑制，靈敏度較低。因此將質(zhì)譜法與高效的衍生化方法相結(jié)合，能夠提高分析的靈敏度。目前已開發(fā)出許多提高甾醇分析靈敏度的衍生化方法[15-16]，例如，Van Berkel等[17]利用二茂鐵離子化反應(yīng)成功鑒定了棕櫚果提取物中的甾醇。Tai等[18]利用丹磺酰氯衍生化顯著提高了人血清中甾醇的測定靈敏度。本課題組開發(fā)了一種新型的甾醇衍生化技術(shù)N-烷基吡啶同位素季銨化反應(yīng)(NAPIQ)，并運用該反應(yīng)對食用油、人的毛發(fā)以及尿液中的甾醇類化合物進行定性定量分析[19-23]。

基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)由于其高靈敏度、高通量以及簡單的樣品處理步驟，已被廣泛應(yīng)用于各種生物樣本中復(fù)雜物質(zhì)的分析。本文運用NAPIQ結(jié)合MALDI-TOF MS，對中藥材中的甾醇進行了定性分析，通過進一步檢測動物來源以及菌類來源的甾醇，對中藥材的霉菌污染情況進行評價，為快速鑒定中藥材霉菌污染狀況提供了可能。

1 實驗部分

1.1 實驗材料

新鮮白杜葉和接骨木采自上海中醫(yī)藥大學(xué)百草園；發(fā)霉白杜葉和接骨木是將新鮮藥材放置后獲得；吡啶(純度>99.9%)購自Sigma-Aldrich公司；三氯甲烷(HPLC級)、二氯甲烷(HPLC級)、三氟甲磺酸酐(Tf2O,99%)購自上?；瘜W(xué)試劑有限公司；氘代吡啶(>99.9%)購自美國Cambridge Isotope Laboratories Inc.；三氟醋酸(TFA,≥ 99.5%)購自Fluka 公司；乙腈(ACN，HPLC級)、乙醇(ETOH,HPLC級)均購自Merck公司；α-氰基-4-羥基肉桂酸(CHCA)購自 Sigma Chemical Co.(St.Louis,MO)；環(huán)四磷腈質(zhì)譜校準(zhǔn)溶液合成于上海有機化學(xué)研究所；實驗用水(18 MΩ·cm)由Milli-Q去離子水凈化器(Millipore,ELPaso,TX)純化；沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基和氯化鈉-蛋白胨緩沖液均購于北京陸橋生物技術(shù)有限公司。

1.2 樣品處理

本實驗分為兩組，一組為新鮮藥材，另一組為發(fā)霉藥材。稱取新鮮藥材和發(fā)霉藥材各0.2 g,用7 mL氯仿浸泡20 min得提取液，兩組提取液各量取1 mL加入衍生化反應(yīng)瓶中，N2吹干，向兩組提取液中均加入30 μL 的20%吡啶二氯甲烷溶液和30 μL的20%氘代吡啶二氯甲烷溶液，再與60 μL 20%三氟甲磺酸酐的二氯甲烷溶液(體積比1∶1)混合，搖床上(220 r/min，30 ℃)反應(yīng)，2 h后向反應(yīng)液中加入30 μL水，12 000 r/min 離心10 min，取下層二氯甲烷層N2吹干，向反應(yīng)瓶中加入30 μL 10 mg/mL的 CHCA基質(zhì)溶液，搖勻后點樣。

1.3 MALDI-TOF MS 分析

質(zhì)譜采集由日本JEOL公司MALDI Spiral-TOF MS(Spiral 3000 MALDI質(zhì)譜儀)完成。后處理軟件為msTornado Analysis，質(zhì)譜條件：Spiral正離子模式，激光能量45%，檢測器靈敏度60%，延遲時間300 ns。質(zhì)量校正采用環(huán)四磷腈質(zhì)譜校準(zhǔn)溶液作為內(nèi)標(biāo)。

1.4 微生物計數(shù)法

樣品處理：取發(fā)霉藥材10 g置于100 mL高溫滅菌的氯化鈉-蛋白胨緩沖液中，制成霉菌懸液。另取10支試管，分別加入9 mL高溫滅菌的緩沖液，向第1支試管中加入1 mL霉菌懸液，搖勻后，取1 mL加至第2支試管中，依次類推，將霉菌懸液稀釋10個梯度。從各個稀釋度的霉菌懸液中取1 mL分別加至10個平板中，加入適量的沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，待其冷凝后置于32 ℃培養(yǎng)7 d，每個稀釋度做3個平行樣本。

陰性對照：取新鮮藥材10 g置于100 mL高溫滅菌的氯化鈉-蛋白胨緩沖液中，制成懸液，按照陽性對照的方法進行稀釋培養(yǎng)，并計數(shù)。

空白對照：取1 mL氯化鈉-蛋白胨緩沖液于培養(yǎng)皿中，加入適量的沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，待其冷凝后32 ℃培養(yǎng)7 d。觀察計數(shù)：微生物數(shù)=平均菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 實驗條件的考察

NAPIQ反應(yīng)是一種以三氟甲磺酸酐為醇羥基的活化試劑，吡啶/氘代吡啶為季銨化試劑的衍生化技術(shù)。其可以特異性地與羥基和α，β-不飽和酮類化合物發(fā)生反應(yīng)，具體反應(yīng)歷程如圖1所示。本實驗利用該反應(yīng)對從植物中提取的甾醇進行了衍生化，三氟甲磺酸酐首先會活化甾醇分子中的羥基，形成三氟甲磺酸酯基，而后吡啶/氘代吡啶取代三氟甲磺酸酯基形成相應(yīng)的季銨鹽，此種季銨鹽在用MALDI-TOF MS進行檢測時可以得到D0/D5的對峰?？疾炝艘掖己吐确伦鳛樘崛∪軇r的影響，結(jié)果顯示，乙醇提取液衍生化后所得到的質(zhì)譜圖信號較差，m/z484、486、488處的甾醇信號強度較低，而用氯仿進行提取所得到的衍生化質(zhì)譜圖中甾醇種類較多，信號較強，因此選用氯仿作為提取液。

圖1 實驗過程Fig.1 The procedure of the experiment

2.2 新鮮中藥材的檢測結(jié)果

運用NAPIQ衍生化反應(yīng)結(jié)合MALDI-TOF MS對新鮮的白杜葉和接骨木進行了檢測，結(jié)果見圖2。根據(jù)MALDI-TOF MS測定結(jié)果，以誤差小于5 ppm為標(biāo)準(zhǔn)，比較譜圖中的實驗質(zhì)荷比與目標(biāo)衍生化產(chǎn)物的理論質(zhì)荷比，分別對新鮮的白杜葉和接骨木中的甾醇種類進行了定性分析。結(jié)果表明，從新鮮的白杜葉中共檢出3種植物甾醇，分別為豆甾-5,7,22-三烯-3-醇、豆甾醇以及谷甾醇，其中豆甾-5,7,22-三烯-3-醇的氘代吡啶衍生物的準(zhǔn)確質(zhì)量數(shù)偏差>5 ppm，這主要是由于受到m/z476.422峰的同位素峰的影響所致。從新鮮的接骨木中共檢出2種植物甾醇，分別為豆甾-5,7,22-三烯-3-醇和谷甾醇。其化合物信息見表1。對這兩份新鮮的藥材進行微生物計數(shù)，均未觀察到霉菌，表明符合藥典標(biāo)準(zhǔn)。

SterolElemental compositionTheoretical (m/z)Euonymus maackii(白杜葉)Sambucus williamsii(接骨木)Measured(m/z)Error(ppm)Measured(m/z)Error(ppm)Stigmasta-5,7,22-trien-3-olC34H50N+472.393 8472.395 43.45472.391 5-4.69(豆甾-5,7,22-三烯-3-醇)C34H45D5N+477.425 2477.422 3-6.03477.423 4-3.65Stigmasterol(豆甾醇)C34H52N+474.409 4474.407 6-3.75-?-C34H47D5N+479.440 8479.438 5-4.91--Sitosterol(谷甾醇)C34H54N+476.425 1476.422 9-4.57476.422 7-4.82C34H49D5N+481.456 4481.454 1-4.90481.454 2-4.70

*not detected

2.3 發(fā)霉中藥材的檢測結(jié)果

運用NAPIQ衍生化方法結(jié)合MALDI-TOF MS對發(fā)霉的白杜葉和接骨木中的甾醇進行檢測，所得質(zhì)譜圖如圖3所示。結(jié)果表明，在發(fā)霉的白杜葉中共檢出8種甾醇，其中麥角甾-4,6,8(9),22-四烯-3-酮、麥角甾醇、4,4-二甲基麥角甾-1,5,7,22-四烯-3-醇、4,4-二甲基麥角甾-5,7,22-三烯-3-醇屬于菌類甾醇，羊毛甾醇屬于動物甾醇，這5種甾醇在新鮮的白杜葉中均未檢出(見表2)；從霉變的接骨木中共檢出7種甾醇，其中麥角甾醇為菌類甾醇，羊毛甾醇和2,5-二氫羊毛甾醇為動物甾醇，這3種甾醇在新鮮的接骨木中均未檢出(見表3)。因此，上述在發(fā)霉藥材中峰度很高的動物甾醇以及菌類甾醇可以作為藥材受霉菌污染狀況的鑒定指標(biāo)。為驗證該方法是否符合藥典標(biāo)準(zhǔn)，對這兩種發(fā)霉藥材進行了微生物計數(shù)，發(fā)霉的白杜葉中微生物數(shù)為2.0×105cfu/g,發(fā)霉的接骨木中微生物數(shù)為2.3×105cfu/g，均大于藥典規(guī)定的102cfu/g，表明這兩種藥材均發(fā)生了霉變。

利用MALDI Spiral-TOF MS的高分辨率優(yōu)勢，可以區(qū)分質(zhì)荷比非常接近的物質(zhì)。例如，麥角甾醇與溶液中干擾組分的質(zhì)荷比非常接近(圖3B)，但可以通過比較其準(zhǔn)確質(zhì)量數(shù)進行區(qū)分，實驗中麥角甾醇的準(zhǔn)確質(zhì)量數(shù)為m/z458.376 1，而干擾物質(zhì)的準(zhǔn)確質(zhì)量數(shù)為m/z458.238 6，由此可以排除干擾組分的影響。

SterolElemental compositionTheoretical(m/z)Measured(m/z)Error(ppm)Ergosta-4,6,8(9),22-tetraen-3-one(麥角甾-4,6,8(9),22-四烯-3-酮)C33H44N+454.346 8454.347 20.82C33H39D5N+459.378 2459.378 91.60Ergosterol(麥角甾醇)C33H48N+458.378 1458.379 53.00C33H43D5N+463.409 5463.411 84.94Stigmasta-5,7,22-trien-3-ol(豆甾-5,7,22-三烯-3-醇)C34H50N+472.393 8472.392 8-2.13C34H45D5N+477.425 2477.424 3-1.92Stigmasterol(豆甾醇)C34H52N+474.409 4474.409 60.37C34H47D5N+479.440 8479.442 74.03Sitosterol(谷甾醇)C34H54N+476.425 1476.424 2-1.78C34H49D5N+481.456 4481.454 5-4.074,4-Dimethylergosta-1,5,7,22-tetraen-3-ol(4,4-二甲基麥角甾-1,5,7,22-四烯-3-醇)C35H50N+484.393 7484.395 74.14C35H45D5N+489.425 2489.426 22.254,4-Dimethylergosta-5,7,22-trien-3-ol(4,4-二甲基麥角甾-5,7,22-三烯-3-醇)C35H52N+486.409 4486.410 82.98C35H47D5N+491.440 8491.441 71.87Lanosterol(羊毛甾醇)C35H54N+488.425 1488.426 63.16C35H49D5N+493.456 5493.458 64.23

表3 霉變接骨木的氯仿提取液衍生化后所得甾醇及其結(jié)果Table 3 Results of sterols extracted with CHCl3 from moldy Sambucus williamsii

3 結(jié) 論

本文運用NAPIQ衍生化反應(yīng)結(jié)合MALDI-TOF MS對新鮮藥材和發(fā)霉藥材中的甾醇類化合物進行了檢測，在兩種新鮮藥材中檢出的甾醇均為植物甾醇，而在發(fā)霉藥材中除了較常見的植物甾醇外，還有動物甾醇及菌類甾醇檢出。這主要是由于藥材受到了霉菌的污染。因此，可以通過藥材中檢測出的甾醇種類對藥材的霉菌污染情況進行快速評價，以對藥材的質(zhì)量進行控制。