楊國(guó)防，劉向哲，王彥華，王新志，彭珂

（1．河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院腦病一區(qū)，河南鄭州450000；2．河南中醫(yī)藥大學(xué)，河南鄭州450000）

腦梗死是臨床上常見(jiàn)的腦血管疾病，顱內(nèi)動(dòng)脈的閉塞會(huì)引起腦組織發(fā)生不可逆的缺血缺氧性損害[1]。近年來(lái)溶栓治療、介入治療等再灌注治療手段發(fā)展迅速，雖然腦梗死發(fā)生后盡早進(jìn)行再灌注治療能夠有效恢復(fù)缺血腦組織的血供，但神經(jīng)細(xì)胞對(duì)缺血缺氧的耐受性差，再灌注治療時(shí)已經(jīng)發(fā)生了不同程度的缺血缺氧損害，容易在治療后遺留神經(jīng)功能缺損[2]。1，25-（OH）2-D3是體內(nèi)維生素D的活性形式，由維生素D經(jīng)兩次羥基化反應(yīng)合成，不僅參與鈣磷代謝的調(diào)控，還被證實(shí)能夠在多種組織和細(xì)胞中通過(guò)抗炎、抗凋亡等途徑發(fā)揮保護(hù)作用[3]。Wnt/β-catenin通路是細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮促增殖、抗凋亡作用的信號(hào)通路，研究證實(shí)激活該通路能夠減輕大腦的缺血缺氧損傷及缺血再灌注損傷[4]。為了明確1，25-（OH）2-D3在腦梗死過(guò)程中的神經(jīng)保護(hù)作用及分子機(jī)制，本研究具體分析了1，25-（OH）2-D3對(duì)腦梗死大鼠神經(jīng)功能、腦組織內(nèi)細(xì)胞凋亡及Wnt/β-catenin通路的調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及材料

SPF級(jí)別的成年雄性SD大鼠，體質(zhì)量240～280g，購(gòu)自廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)SCXK（豫）2019-0035。1,25-（OH）2-D3購(gòu)自Sigma公司，TUNEL染色試劑盒購(gòu)自上海碧云天公司，Bcl-2、Bax、β-catenin的單克隆抗體購(gòu)自Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組及給藥方法 SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、腦梗死組、干預(yù)組，腦梗死組、干預(yù)組采用線栓法建立腦梗死大鼠模型：腹腔注射10%水合氯醛麻醉后擺放仰臥位，做頸正中切口后分離左側(cè)頸總動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈，用縫線結(jié)扎頸外動(dòng)脈并離斷，用動(dòng)脈夾暫時(shí)夾閉頸總動(dòng)脈，在頸外動(dòng)脈末端處剪一小口，將線栓伸入至大腦中動(dòng)脈，深度約1.8～2.0 cm，遇到阻力后停止并固定線栓，縫合切口完成造模。假手術(shù)組僅進(jìn)行腹腔麻醉及分離左側(cè)頸總動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈的操作。干預(yù)組在造模前8天每天給予1.0 μg/kg的1，25-（OH）2-D3腹腔注射，同時(shí)在造模后即刻給予 1.0 μg/kg的1，25-（OH）2-D3腹腔注射。

1.2.2 神經(jīng)功能評(píng)估 建模成功后24小時(shí)，按照5分法評(píng)估各組大鼠神經(jīng)功能：無(wú)神經(jīng)損害癥狀為0分，對(duì)側(cè)前爪不能完全伸展為1分，行走時(shí)向?qū)?cè)旋轉(zhuǎn)為2分，行走時(shí)向?qū)?cè)傾倒為3分，不能自發(fā)行走或意識(shí)喪失為4分。

1.2.3 腦梗死體積測(cè)定 完成神經(jīng)功能評(píng)估后，各組隨機(jī)取6只大鼠用于腦梗死體積的測(cè)定，解剖腦組織后在腦磨具中切為厚度2 mm的腦片，用2%四唑紅（TTC）溶液染色30分鐘后拍照記錄，紅色染色部分為正常腦組織、白色染色部分為腦梗死組織，以腦梗死組織體積/（腦梗死組織體積+正常腦組織體積）的比值作為腦梗死體積。

1.2.4 TUNEL染色 完成神經(jīng)功能評(píng)估后，各組隨機(jī)取6只大鼠，處死后解剖得到梗死部位的腦組織，一半用于多聚甲醛固定后制作切片，用TUNEL試劑盒進(jìn)行染色后在顯微鏡下觀察，隨機(jī)計(jì)數(shù)5個(gè)高倍視野下TUNEL陽(yáng)性染色細(xì)胞所占比例。

1.2.5 基因表達(dá)的Western blot測(cè)定 取用于TUNEL染色后剩余的另一半腦組織，加入蛋白裂解液提取總蛋白后進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）。在SDS-聚丙烯酰胺凝膠的點(diǎn)樣槽內(nèi)加入蛋白樣本，垂直電泳后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，將蛋白樣本從聚丙烯酰胺凝膠轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素（NC）膜，NC膜放置在5%脫脂牛奶封閉2小時(shí)，而后在4℃孵育1:1 000稀釋的Bax、Bcl-2、Caspase-3、β-catenin、GSK-3β及β-actin的抗體過(guò)夜，第二天取出用TBST緩沖液洗滌三遍后孵育第二抗體1小時(shí)，再用TBST緩沖液洗滌三遍后加入顯影液，在顯影系統(tǒng)內(nèi)顯影得到蛋白條帶，用Image-J軟件掃描蛋白條帶灰度值，計(jì)算 Bax/β-actin、Bcl-2/β-actin、Caspase-3/β-actin、β-catenin/β-actin、GSK-3β/β-actin 的比值作為 Bax、Bcl-2、Caspase-3、β-catenin、GSK-3β 的表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以“±s”表示，采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組神經(jīng)功能評(píng)分及腦梗死體積比較

腦梗死組大鼠的神經(jīng)功能評(píng)分明顯高于假手術(shù)組及干預(yù)組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；干預(yù)組大鼠的腦梗死體積明顯低于腦梗死組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表1 各組間腦組織中β-catenin、GSK-3β表達(dá)量的比較

2.2 各組腦組織TUNEL陽(yáng)性率比較

TUNEL染色檢測(cè)腦組織中的細(xì)胞凋亡，染色圖如圖1所示。計(jì)數(shù)各組大鼠腦組織中TUNEL陽(yáng)性染色細(xì)胞所占比例，腦梗死組大鼠腦組織的TUNEL陽(yáng)性率明顯高于假手術(shù)組及干預(yù)組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

圖1 各組大鼠腦組織的TUNEL染色圖

表2 各組腦組織中TUNEL陽(yáng)性率比較

2.3 各組腦組織中凋亡基因表達(dá)比較

Western blot檢測(cè)腦組織中凋亡基因Bax、Bcl-2、Caspase-3的蛋白表達(dá)，蛋白電泳圖如圖2所示。計(jì)算各組大鼠腦組織中凋亡基因的表達(dá)量，腦梗死組大鼠腦組織中Bax及Caspase-3的表達(dá)量均明顯高于假手術(shù)組及干預(yù)組，Bcl-2的表達(dá)量明顯低于假手術(shù)組及干預(yù)組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表3

圖2 各組大鼠腦組織中Bax、Bcl-2、Caspase-3的蛋白電泳圖

表3 各組腦組織中Bax、Bcl-2、Caspase-3表達(dá)量的比較

2.4 各組間腦組織中β-catenin、GSK-3β表達(dá)的比較

Western blot檢測(cè)腦組織中凋亡基因β-catenin、GSK-3β的蛋白表達(dá)，蛋白電泳圖如圖3所示。計(jì)算各組大鼠腦組織中凋亡基因的表達(dá)量，如表4所示，腦梗死組大鼠腦組織中β-catenin的表達(dá)量均明顯低于假手術(shù)組、GSK-3β的表達(dá)量明顯高于假手術(shù)組，干預(yù)組大鼠腦組織中β-catenin的表達(dá)量均明顯高于腦梗死組、GSK-3β的表達(dá)量明顯低于腦梗死組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖3 各組大鼠腦組織中β-catenin、GSK-3β的蛋白電泳圖

表4 各組腦組織中β-catenin、GSK-3β表達(dá)量比較

3 討論

腦梗死是具有較高致殘率和致死率的腦血管疾病[5]。近年來(lái)隨著糖尿病、高血壓等代謝性疾病發(fā)生的增多，腦梗死的發(fā)病率也呈逐年升高趨勢(shì)，針對(duì)腦梗死的治療也取得了長(zhǎng)足進(jìn)步，靜脈溶栓及介入取栓等治療手段能夠使缺血腦組織及時(shí)獲得血流再灌注[6]。盡管如此，腦組織中神經(jīng)細(xì)胞對(duì)缺血缺氧的耐受能力較差，在接受再灌注治療時(shí)已經(jīng)發(fā)生了不可逆損害，治療后遺留神經(jīng)功能缺失[7]。此外，再灌注治療對(duì)時(shí)間窗的要求嚴(yán)格，大多數(shù)錯(cuò)過(guò)再灌注治療時(shí)間窗的腦梗死患者會(huì)遺留更為嚴(yán)重的神經(jīng)功能缺損[8]。因此，如何在腦梗死發(fā)生后有效的保護(hù)神經(jīng)功能是臨床研究的熱點(diǎn)。

1，25-（OH）2-D3是維生素D的活性形式，由維生素D經(jīng)過(guò)連續(xù)兩次羥基化反應(yīng)生成，具有調(diào)節(jié)鈣磷代謝、增加血漿中鈣磷水平以滿足骨代謝需求的作用[9]。近年來(lái)相關(guān)的研究發(fā)現(xiàn)1，25-（OH）2-D3具有除調(diào)節(jié)鈣磷代謝外的其他多種生物學(xué)活性，其中由1，25-（OH）2-D3介導(dǎo)的細(xì)胞保護(hù)作用受到越來(lái)越多的關(guān)注。心肌、肝臟、牙齦等多個(gè)組織的基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)，1，25-（OH）2-D3能夠通過(guò)抗凋亡、抗炎、抗氧化等機(jī)制來(lái)減輕不同病理因素引起的組織和細(xì)胞損傷[10]。為了明確1，25-（OH）2-D3在腦梗死中的治療價(jià)值，本研究首先通過(guò)線栓法建立了腦梗死大鼠模型，通過(guò)觀察神經(jīng)功能評(píng)分及腦梗死面積發(fā)現(xiàn)：腦梗死組大鼠的神經(jīng)功能評(píng)分明顯升高、梗死腦體積達(dá)到（55.41±8.72）%。在成功建立腦梗死大鼠模型的基礎(chǔ)上給予1，25-（OH）2-D3干預(yù)并觀察到：干預(yù)組大鼠的神經(jīng)功能評(píng)分及腦梗死體積均明顯低于腦梗死組，提示1，25-（OH）2-D3能夠在腦梗死大鼠模型中發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

線粒體途徑細(xì)胞凋亡的激活是腦梗死過(guò)程中介導(dǎo)神經(jīng)功能損害的重要病理環(huán)節(jié)[11]。Bax和Bcl-2是線粒體膜上調(diào)控線粒體途徑凋亡的分子，前者能夠形成細(xì)胞色素C的孔道，促進(jìn)線粒體內(nèi)的細(xì)胞色素C進(jìn)入胞漿并激活Caspase介導(dǎo)的級(jí)聯(lián)放大反應(yīng)，最終通過(guò)激活Caspase-3來(lái)引起細(xì)胞凋亡；后者能夠與Bax形成異源二聚體并阻礙細(xì)胞色素C的釋放，最終通過(guò)拮抗Caspase的級(jí)聯(lián)激活來(lái)抑制細(xì)胞凋亡[12]。本研究對(duì)腦梗死大鼠腦組織中線粒體途徑凋亡基因表達(dá)的分析顯示：腦梗死組大鼠腦組織中Bcl-2的表達(dá)量明顯降低，而B(niǎo)ax、Caspase-3的表達(dá)量明顯增多，提示腦梗死模型大鼠的腦組織中線粒體凋亡明顯增強(qiáng)。進(jìn)一步分析1，25-（OH）2-D3干預(yù)對(duì)腦梗死大鼠腦組織中線粒體凋亡的影響可知：干預(yù)組大鼠腦組織中Bcl-2的表達(dá)量明顯高于腦梗死組，Bax、Caspase-3的表達(dá)量明顯低于腦梗死組，提示1,25-（OH）2-D3干預(yù)能夠抑制腦梗死大鼠腦組織中的細(xì)胞凋亡。

Wnt/β-catenin通路是細(xì)胞中調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡的重要信號(hào)通路[13]。Wnt是該通路的上游信號(hào)分子，發(fā)生活化后能夠使細(xì)胞內(nèi)β-catenin、GSK-3β、APC、Axin形成的復(fù)合體發(fā)生解離，GSK-3β對(duì)β-catenin的水解作用減弱，進(jìn)而造成β-catenin在細(xì)胞漿中不斷堆積并逐步向細(xì)胞核轉(zhuǎn)移；進(jìn)入細(xì)胞核的β-catenin能夠通過(guò)Tcf/Lef來(lái)調(diào)節(jié)Bax、Bcl-2等基因的表達(dá)。本研究對(duì)Wnt/β-catenin通路的分析顯示，腦梗死組大鼠腦組織中β-catenin的表達(dá)量均明顯降低、GSK-3β的表達(dá)量明顯升高，而在使用1,25-（OH）2-D3干預(yù)后的干預(yù)組大鼠腦組織中β-catenin的表達(dá)量均明顯升高、GSK-3β的表達(dá)量明顯降低，提示W(wǎng)nt/β-catenin通路在腦梗死過(guò)程中受到抑制，1，25-（OH）2-D3干預(yù)能夠激活腦梗死組織中的Wnt/β-catenin通路，進(jìn)而通過(guò)該通路介導(dǎo)的促增殖及抗凋亡效應(yīng)來(lái)實(shí)現(xiàn)保護(hù)腦梗死大鼠神經(jīng)功能的目的。

綜上所述，1，25-（OH）2-D3用于腦梗死大鼠能夠改善神經(jīng)功能、減輕腦組織內(nèi)細(xì)胞凋亡，激活Wnt/β-catenin通路是其可能分子機(jī)制，為臨床上探尋腦梗死新的治療藥物提供了依據(jù)。