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布魯氏菌病是一種由布魯氏菌(Brucella)引起的流行范圍廣的人獸共患傳染病之一，是《中華人民共和國傳染病防疫法》規(guī)定的乙類傳染病[1]。人類感染布魯氏菌病主要表現(xiàn)為波狀熱、盜汗、關(guān)節(jié)炎，甚至導(dǎo)致不孕不育等;公畜感染易引起睪丸炎，懷孕母畜感染易導(dǎo)致流產(chǎn)[2]。布魯氏菌病在世界各地都有發(fā)生，給畜牧業(yè)發(fā)展和人類健康帶來了嚴重威脅。因此，對該病的研究受世界各國學(xué)者的高度重視[3]。

布魯氏菌是兼性胞內(nèi)寄生的革蘭氏陰性菌，呈球形或短桿狀，菌體長0.6～1.5 μm,寬0.5～0.7 μm，其主要寄生于巨噬細胞和胚胎滋養(yǎng)層細胞[4-5]。近年來，對布魯氏菌毒力因子的研究已成為國內(nèi)外學(xué)者研究的重點，布魯氏菌無經(jīng)典的毒力因子，其毒力與侵入宿主細胞、抵抗宿主細胞殺傷作用以及胞內(nèi)生殖有關(guān)[6]。

DsbG是最早顯示具有一般分子伴侶活性的周質(zhì)蛋白之一，這種陪伴蛋白質(zhì)折疊的能力可能增加DsbG作為蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶的有效性[7]。本研究小組前期利用蛋白質(zhì)組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)；DsbG在布魯氏菌毒力株2308和疫苗株RB51之間的表達存在差異，因此，本研究以布魯氏菌2308毒力株的dsbG基因為基礎(chǔ)，以布魯氏菌2308作為研究對象，利用抗性替代構(gòu)建差異表達蛋白DsbG的基因突變株，研究其遺傳穩(wěn)定性和生長狀態(tài)，并研究其在HPT-8細胞中的存活和繁殖能力，為探索布魯氏菌潛在毒力因子奠定基礎(chǔ)，為進一步揭示布魯氏菌感染與懷孕母畜流產(chǎn)之間的分子機制提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材 料

1.1.1菌株和細胞 牛種布魯氏菌2308毒力株購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；RB51疫苗株由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)吳清民教授惠贈；pUC19K載體由北京軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院惠贈；人胚胎滋養(yǎng)層細胞(HPT-8)由石河子大學(xué)動物科技學(xué)院人獸共患傳染病實驗室保存；大腸埃希菌(Escherichiacoli, DH5a)、pMD19-T simple載體購自TaKaRa公司。

1.1.2試劑 DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購自Gibco公司；硫酸慶大霉素購自河南輔仁懷慶制藥有限公司；0.22 μmol/L濾器購自美國Milipore公司；細胞培養(yǎng)板購自COSTAR公司；BrucellaBroth培養(yǎng)基和BrucellaAgar培養(yǎng)基購自美國BD公司；質(zhì)粒小提取試劑盒和dNTP購自Tiangen Biochemical Technology Co., Ltd.；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方 法

1.2.1引物設(shè)計與合成 利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計相應(yīng)引物，送華大基因合成，引物序列見表1。

表1 引物和序列Tab.1 Primer and sequences

primerPrimer sequences (5′-3′)dsbG-N-FTGTAGGCAGCAGGATTGATGAdsbG -N-RGACATTCATCCCAGGTGGCAGATATCG-GTCGCGCCCGGCTGdsbG -C-FTCTGGGGTTCGAAATGACCGGCCGATAAT-ACCGCTCGCTATdsbG -C-RTGATGCTGACAGGCACGAAdsbG-I-FTTACTTCTTTGCAGCGTCCCdsbG -I-RTTGGTTGCGCATGGTATCGGdsbG -E-FAGGCAGCAGGATTGATGAGGdsbG -E-RAACAGATGAAGCCGGGAACKan -FGCCACCTGGGATGAATGTCKan -RCGGTCATTTCGAACCCCAGA

1.2.2布魯氏菌dsbG突變株自殺載體的構(gòu)建 以牛種布魯氏菌2308的DNA為模板，以dsbG-N-F和dsbG-N-R為引物擴增dsbG基因的N端同源臂和以dsbG-C-F和dsbG-C-R為引物擴增其C端同源臂，以pUC19K質(zhì)粒為模板，以Kan-F和Kan-R作為引物擴增卡那霉素抗性片段。通過融合PCR技術(shù)，對dsbG基因的N端同源臂、卡那霉素抗性片段和C端同源臂進行融合擴增?；厥杖诤掀萎a(chǎn)物并連接到pMD19-T載體上，轉(zhuǎn)化到DH5a感受態(tài)細胞中，通過PCR鑒定，并送生工生物工程股份有限公司進行測序。

1.2.3布魯氏菌dsbG突變株的構(gòu)建 將質(zhì)粒pMD-DK-Kan電轉(zhuǎn)化到2308感受態(tài)細胞中，活化后涂于帶卡那霉素抗性的布魯氏菌固體培養(yǎng)基，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)48～72 h，挑取單個細菌，分別用卡那霉素替換目的基因的內(nèi)、外部鑒定引物進行PCR鑒定，獲得2308ΔdsbG突變株。

1.2.4布魯氏菌2308ΔdsbG突變株的遺傳穩(wěn)定性檢測 將初步篩選獲得的布魯氏菌2308ΔdsbG突變株反復(fù)傳代培養(yǎng)10代后，通過內(nèi)、外部檢測引物對2308ΔdsbG突變株進行PCR鑒定和遺傳穩(wěn)定性檢測。回收外部引物獲得的基因片段送至華大基因測序。

1.2.5布魯氏菌親本株和突變株生長曲線測定 布魯氏菌2308、RB51和2308ΔdsbG突變株在相同起始濃度下，于37 ℃，170 r/min條件下培養(yǎng)。間隔2 h取樣1次，檢測OD600的變化，直到細菌進入平臺期，并繪制2308、RB51和2308ΔdsbG突變株的生長曲線。

1.2.6布魯氏菌侵染HPT-8細胞形態(tài)學(xué)觀察 分別用對數(shù)生長期的布魯氏菌2308、RB51和2308ΔdsbG突變株按200∶1感染復(fù)數(shù)侵染HPT-8細胞，24 h后棄去培養(yǎng)液，用PBS漂洗3次，并與含有50 μg/mL慶大霉素的液體培養(yǎng)基共孵育60 min，以殺死胞外的布魯氏菌，用倒置顯微鏡觀察細胞的形態(tài)學(xué)變化。

1.2.7布魯氏菌粘附侵襲實驗 分別使用布魯氏菌2308、RB51和2308ΔdsbG突變株按200∶1感染復(fù)數(shù)侵染HPT-8細胞，并在5% CO237 ℃環(huán)境中共孵育10 min、20 min、40 min、60 min、90 min和120 min后，用PBS漂洗3次，除去未粘附的細菌，再與含有50 μg/mL慶大霉素的DMEM培養(yǎng)液共孵育60 min以殺死胞外菌。用0.2% Tritonx-100裂解細胞，稀釋后涂于布魯氏菌固體培養(yǎng)基。3～5 d后，通過計算CFU，比較2308、RB51和2308ΔdsbG突變株的粘附侵襲能力。

? E.H.Gombrich,“ An early seventeenth-century canon of artistic excellence：Pierleone Casella's elogia illustrium artificum of 1606”,Journal of the Warburg and Courtauld Institutes,vol.50，1987，pp.224-32.

1.2.8布魯氏菌胞內(nèi)繁殖實驗 分別用布魯氏菌2308、RB51和2308ΔdsbG突變株按200∶1的感染復(fù)數(shù)侵染HPT-8細胞，60 min后，用慶大霉素殺死胞外菌，分別在0 h、4 h、8 h、12 h和24 h棄去培養(yǎng)液，PBS漂洗3次。用0.2% Tritonx-100裂解細胞，稀釋后涂于布魯氏菌固體培養(yǎng)基，3～5 d后，通過計算CFU，比較并分析布魯氏菌2308、RB51和2308ΔdsbG突變株的胞內(nèi)繁殖能力。

1.2.9統(tǒng)計學(xué)分析 利用SPSS Statistics 17.0分析軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，P<0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1布魯氏菌dsbG基因突變株的構(gòu)建

2.1.1dsbG基因同源臂及卡那霉素抗性基因的擴增 以金屬浴滅活的布魯氏菌2308為模板，PCR擴增dsbG基因的上、下游同源臂序列，分別獲得約為500 bp(圖1A)和399 bp(圖1B)的片段；以pUC19K質(zhì)粒為模板，擴增卡那霉素抗性片段，獲得大小約為1 093 bp的片段(圖1C)；獲得條帶大小與預(yù)期值相符。

A: M，DNA marker;1，陰性對照; 2～3，dsbG-N PCR產(chǎn)物B: M，DNA marker;1，陰性對照; 2～3，dsbG-N PCR產(chǎn)物C: M，DNA marker;1，陰性對照; 2～5，Kan PCR產(chǎn)物圖1 dsbG基因同源臂及卡那霉素抗性基因的PCR擴增Fig.1 PCR amplification of the dsbG gene homology arm and kanamycin resistance gene

2.1.2dsbG基因同源臂和卡那霉素抗性基因的融合 通過融合PCR技術(shù)將上述3個基因片段進行融合擴增，獲得大小約為1 992 bp的基因片段，其與dsbG基因上下游同源臂片段和卡那霉素抗性基因片段預(yù)期疊加相符(圖2)。

2.1.3布魯氏菌dsbG突變株載體的構(gòu)建及鑒定 將pMD19-T載體連接到融合片段上，并轉(zhuǎn)化至DH5a感受態(tài)細胞中，獲得同源重組載體pMD19-T-ΔdsbG-K(1 992 bp), PCR驗證結(jié)果與疊加片段大小相同(圖3)。

M: DNA marker; 1～3: dsbG-N-K-C 融合PCR產(chǎn)物圖2 dsbG-N-K-C融合PCR擴增 Fig.2 dsbG-N-K-C fusion PCR amplification

M: DNA marker;1: 陰性對照；2～4:pMD19-T-ΔdsbG-Kan PCR產(chǎn)物圖3 同源重組載體pMD19-T-ΔdsbG-Kan 的菌液PCR鑒定Fig.3 Identification of pMD19-T-ΔdsbG-Kan was amplified via PCR

2.2布魯氏菌2308ΔdsbG基因突變株的初步篩選及鑒定 使用dsbG-N-F和Kan-R鑒定引物分別對2308ΔdsbG突變株和2308親本株進行擴增，結(jié)果顯示： 2308ΔdsbG突變株可擴增出預(yù)期大小相符(1 593 bp)的特異片段，而2308親本株擴增為陰性，如圖4所示：表明抗性基因正確替代了dsbG基因。

M: DNA marker；1: 陰性對照；2: 2308對照；3～5:檢測菌液圖4 2308ΔdsbG的篩選鑒定Fig.4 Screening and identification of 2308ΔdsbG

表2 檢測引物及片段長度
Tab.2 Detection primer and fragment length

檢測引物敲除前大小/bp敲除后大小/bpdsbG internal detec-tion primerdsbG-I-FdsbG-I-R7530dsbG external detec-tion primerdsbG-E-FdsbG-E-R1 4001 740

結(jié)果顯示：構(gòu)建的基因缺失株在缺失前后所擴增的片段與理論值相符，外部引物獲得基因經(jīng)測序后比對序列，同源性為100%，表明成功獲得了2308ΔdsbG基因缺失株，并且在連續(xù)培養(yǎng)10代后未觀察到回復(fù)現(xiàn)象，即2308ΔdsbG突變株可進行穩(wěn)定遺傳，如圖所示(5A、B)。

A:M，DNA maker; 1，陰性對照; 2，S2308; 3，PMD19-T-ΔdsbG-Kan 質(zhì)粒對照；4～13，S2308ΔdsbG基因突變株B:1，陰性對照; 2，S2308; M，DNA maker; 3～12，S2308ΔdsbG基因突變株圖5 布魯氏菌S2308ΔdsbG的遺傳穩(wěn)定性檢測Fig.5 Genetic stability detection of Brucella S2308ΔdsbG

2.4突變株和親本株的生長曲線分析 繪制布魯氏菌2308、RB51和2308ΔdsbG突變株的生長曲線(圖6)。從生長曲線可以看出，這些菌株的生長趨勢相似，并且同一時間點菌液濃度僅存在細微差異。

圖6 布魯氏菌生長曲線Fig.6 Growth curve of Brucella strains

2.5胚胎滋養(yǎng)層細胞形態(tài)學(xué)觀察 布魯氏菌2308、 RB51和2308ΔdsbG突變株侵染HTP-8細胞后，使用倒置顯微鏡觀察侵染前后的細胞形態(tài)變化。如圖7所示：我們觀察到正常細胞呈多邊形，培養(yǎng)48 h后成片狀或簇狀生長，用布魯氏菌2308侵染后的細胞呈圓形、皺縮現(xiàn)象較為嚴重，間隙變寬，有少量的細胞脫落和碎片。然而用RB51和2308ΔdsbG突變株侵染后的細胞易出現(xiàn)聚合現(xiàn)象，邊界模糊，并伴有輕微脫落。

2.6布魯氏菌的粘附侵襲能力 不同時間點的布魯氏菌2308、RB51和2308ΔdsbG突變株侵入HPT-8細胞的數(shù)量有所差異。如圖8所示：隨著時間延長，進入細胞的布魯氏菌數(shù)量逐漸增加，各菌株約在60 min后侵入細胞的數(shù)量接近飽和不再增加。2308ΔdsbG突變株在每個時間點的粘附侵襲能力顯著低于親本株2308和疫苗株RB51(F=1.201,P<0.05)。

A：2308組；B：RB51組；C：2308ΔdsbG組；D：PBS組圖7 胚胎滋養(yǎng)層細胞侵染前后的變化Fig.7 Change of the trophoblast cell infected with different Brucella

注：*代表P<0.05圖8 布魯氏菌對胚胎滋養(yǎng)層細胞的粘附侵襲能力Fig.8 Invasive ability of Brucella in HPT-8

2.7布魯氏菌的胞內(nèi)繁殖能力 布魯氏菌2308、RB51和2308ΔdsbG突變株在HPT-8細胞內(nèi)具有不同的生存復(fù)制能力。如圖9所示：侵染后各時間點2308ΔdsbG突變株的胞內(nèi)存活能力顯著低于親本株2308和疫苗株RB51(F=8.627,P<0.05)。

注：*代表P<0.05圖9 布魯氏菌的胞內(nèi)存活能力Fig.9 Intracellular survival ability of Brucella

3 討 論

布魯氏菌雖無典型的毒力因子，如外毒素、質(zhì)粒、菌毛、莢膜等，但它具有較強的致病性，特別是對懷孕母畜，常引起懷孕母畜流產(chǎn)[8]。主要原因是布魯氏菌對懷孕母畜胎盤具有較強的親嗜性，胎盤中的赤蘚醇有助于布魯氏菌生長，而布魯氏菌能夠侵入胚胎滋養(yǎng)層細胞，胚胎滋養(yǎng)層細胞是母體和胎兒聯(lián)系的紐帶，一旦受損，就會導(dǎo)致懷孕母畜流產(chǎn), 這可能是布魯氏菌能夠引起懷孕母畜流產(chǎn)的發(fā)病機制之一，其具體分子機制還需做進一步研究[9]。前期本課題組對2308強毒株和RB51疫苗株的差異蛋白組學(xué)進行研究，發(fā)現(xiàn)了多個差異表達蛋白，如DsbG等，RB51疫苗是通過2308強毒株體外傳代篩選后獲得的弱毒疫苗株，其與2308強毒株的差異表達蛋白對毒力因子的挖掘具有重要意義。

已有研究表明，氧化還原物是布魯氏菌的關(guān)鍵毒力因子之一，如cydB、narG和norE等；Dsb蛋白家族是可溶性的巰基二硫鍵氧化還原酶[10]。Dsb蛋白質(zhì)不僅在調(diào)制細菌分泌中發(fā)揮作用，而且影響著膜蛋白質(zhì)折疊過程中二硫鍵的形成和重排[11]。DsbG是Dsb蛋白家族的成員之一，有二硫鍵異構(gòu)酶和分子伴侶活性。有研究表明DsbG在催化折疊或部分折疊蛋白質(zhì)的二硫鍵重排中占優(yōu)勢[11]。在細胞周質(zhì)中，DsbG在新易位蛋白的氧化方面優(yōu)先于DsbA或DsbC的氧化。因此對布魯氏菌dsbG基因功能的探索有助于明確其在毒力和致病性中的作用。

在本研究中，我們成功構(gòu)建了2308ΔdsbG突變株，發(fā)現(xiàn)dsbG基因的缺失影響布魯氏菌對宿主細胞的致病性。布魯氏菌可侵入胚胎滋養(yǎng)層細胞，并引起其形態(tài)發(fā)生改變；對不同時間段進入胚胎滋養(yǎng)層細胞內(nèi)的布魯氏菌數(shù)量進行分析發(fā)現(xiàn)，dsbG基因缺失后，進入細胞內(nèi)的布魯氏菌數(shù)量顯著低于親本株，說明該基因可能是調(diào)控布魯氏菌侵入胚胎滋養(yǎng)層細胞的關(guān)鍵分子之一，如需確定該基因所發(fā)揮的具體功能，還需在細胞實驗(如小鼠巨噬細胞)和動物實驗進行進一步的探索和研究。本研究選用胚胎滋養(yǎng)層細胞對布魯氏菌dsbG基因進行研究，有利于布魯氏菌流產(chǎn)機制的闡述，也為進一步解析布魯氏菌的致病機制和新型疫苗的開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

利益沖突：無

引用本文格式：楊寧寧,徐明國,張歡,等.牛種布魯氏菌2308強毒株dsbG基因缺失突變株的構(gòu)建與初步評價[J].中國人獸共患學(xué)報,2019,35(5):370-375.DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2019.00.047