李曉，方帷，熊粟栗，袁文娟，高婧琪，李華志，張杰*

1(四川大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,四川 成都，610064) 2(生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(四川大學(xué))，四川 成都，610064) 3(四川省資中縣銀山鴻展工業(yè)有限公司，四川 資中，641200)

真菌毒素是各種霉菌在適宜的溫度、濕度及生長(zhǎng)基質(zhì)上產(chǎn)生的高毒性代謝產(chǎn)物，其中，鐮刀菌、青霉、曲霉是產(chǎn)生霉菌毒素的主要霉菌[1]。脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(deoxynivalenol，DON)，俗稱嘔吐霉素，是最常見的真菌毒素之一，屬于單端孢霉烯族毒素，主要由禾谷鐮刀菌和粉紅鐮刀菌產(chǎn)生[2]。DON感染農(nóng)作物時(shí)會(huì)加重作物赤霉病的發(fā)病程度，降低糧食的產(chǎn)量和品質(zhì)[3]；而且具有很強(qiáng)的細(xì)胞毒性，即使在DON濃度較低的情況下，長(zhǎng)期攝入也會(huì)損害人類和動(dòng)物的健康[4]，如發(fā)生厭食、嘔吐、腹瀉、反應(yīng)遲鈍、神經(jīng)障礙等多種癥狀[5-7]，嚴(yán)重時(shí)還可能使造血系統(tǒng)受到損害從而造成死亡[8]。

DON在全世界范圍內(nèi)對(duì)糧食的污染都很普遍，特別是在中國(guó)、美國(guó)、阿根廷等糧食生產(chǎn)區(qū)的污染情況更為突出，有的地區(qū)其檢出含量最高者可達(dá)6.496 mg/kg[9]。中國(guó)政府規(guī)定面粉、大米、玉米等食品中DON的最高限量為1 mg/kg，動(dòng)物飼料中DON最高限量為5 mg/kg。該毒素是造成糧食污染的重要原因之一，并逐步蔓延至乙醇發(fā)酵工業(yè)，被污染的糧食谷物經(jīng)發(fā)酵、蒸餾后，大量DON聚集濃縮在發(fā)酵糟液中，嚴(yán)重影響了發(fā)酵副產(chǎn)品酒糟蛋白飼料(distillers dried grains with soluble，DDGS)的品質(zhì)[10]。DDGS是一種高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的動(dòng)物飼料，積累在DDGS中的毒素可通過食物鏈傳遞，最終影響動(dòng)物和人類的健康，因此尋找一種經(jīng)濟(jì)有效的DON脫毒方法十分必要。用紫外光照射[11]、臭氧降解[12-13]、微波處理[14]、加壓加熱[15-16]等方式對(duì)DON進(jìn)行處理，或使用從自然界中篩選的DON降解菌進(jìn)行生物降解[17]，均取得了一定的進(jìn)展。

ClO2是國(guó)際公認(rèn)的安全、無(wú)毒的綠色消毒劑，具有強(qiáng)氧化性及廣譜殺菌效力，且不會(huì)對(duì)環(huán)境造成二次污染，無(wú)“三致效應(yīng)”(致癌、致畸、致突變)[18]，被廣泛地應(yīng)用于自來(lái)水消毒[19-20]、食品保鮮[21]、面粉和紙漿的漂白、醫(yī)療滅菌[22]等方面。現(xiàn)已有研究顯示，500 mg/L ClO2對(duì)黃曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮有較好的降解效果[23]，但就ClO2對(duì)DON是否具有同樣的降解效果，這方面的研究還很少，本文就ClO2對(duì)DON純品及玉米乙醇發(fā)酵糟液中的DON的降解效果作了初步研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

經(jīng)發(fā)酵蒸餾后的玉米乙醇發(fā)酵糟液，取樣于四川省資陽(yáng)市銀山鴻展工業(yè)有限責(zé)任公司酒廠；脫氧雪腐鐮刀菌烯醇標(biāo)準(zhǔn)品，美國(guó)Sigma公司；色譜甲醇、乙腈，成都蜀都有限公司；ClO2粉末(純度>98%)，北京湘怡源生環(huán)保科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

高效液相色譜系統(tǒng)(Waters 1525-2998PDA)，美國(guó)Waters科技有限有公司；質(zhì)譜儀(TSQ Quantum Ultra)，賽默飛世紀(jì)爾科技有限公司；高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)(Centrifuge 5804R)，艾本德(Eppendorf)科技有限公司；超聲波清洗儀(PS-20)，潔康有限公司；Oasis HLB固相萃取柱，沃特世科技(上海)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 DON標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液及工作液的制備

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：精確稱量5.0 mg的DON標(biāo)準(zhǔn)品于5 mL容量瓶中，色譜甲醇溶解，定容后配制成1.0 mg/mL的DON標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于0～4 ℃冷藏備用。

標(biāo)準(zhǔn)工作液：將DON標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用超純水稀釋為質(zhì)量濃度0.10、0.20、0.50、1.00、5.00、10.00、20.00 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3.2 不同質(zhì)量濃度ClO2對(duì)DON純品的影響

準(zhǔn)確稱取25.0 g ClO2粉末于1 L容量瓶中，用超純水溶解，定容，配制成2 000.0 mg/L的ClO2濃溶液，避光密封保存，備用。

將ClO2濃溶液用超純水稀釋為質(zhì)量濃度為50.0、100.0、150.0、300.0、600.0、900.0、1 200.0、1 500.0 mg/L的ClO2處理液，并向其中添加DON純品，使DON的終濃度為5 μg/mL。室溫下避光靜置處理，并于12、24、36和48 h分別取樣檢測(cè)DON的含量。

1.3.3 ClO2對(duì)玉米乙醇發(fā)酵糟液中DON的影響

準(zhǔn)確稱取5.0 g玉米乙醇發(fā)酵糟液，向其中加入5 mL質(zhì)量濃度50.0、100.0、150.0、300.0、600.0 mg/L的ClO2溶液，室溫下避光處理12 h。

12 h處理后，加入20 mLV(乙腈)∶V(水)=84∶16提取液，40 ℃恒溫下超聲提取30 min，8 000 r/min離心5 min，取6 mL上清液于Oasis HLB小柱上樣過濾(小柱提前用3 mL甲醇和3 mL去離子水預(yù)活化)，過濾后用3 mL去離子水淋洗柱，空氣抽干小柱，2 mL甲醇洗脫，45 ℃氮?dú)獯蹈?，? mL色譜甲醇復(fù)溶，經(jīng)0.22 μm有機(jī)濾膜過濾后進(jìn)樣檢測(cè)。

1.3.4 pH值對(duì)DON純品降解的影響

使用pH計(jì)對(duì)玉米乙醇發(fā)酵糟液以及600.0 mg/L ClO2溶液的pH值進(jìn)行測(cè)定。根據(jù)pH值測(cè)定結(jié)果，將600.0 mg/L的ClO2溶液pH值用1 mol/L的HCl和1 mol/L的NaOH溶液分別調(diào)節(jié)至3.5、4.5、5.5、6.5、7.5，并向其中添加DON純品，使DON的終濃度為5 μg/mL。室溫下處理12 h，取樣檢測(cè)DON含量。

1.3.5 DON含量的檢測(cè)

HPLC條件[24]：色譜柱：Waters C18column(250 mm×4.6 mm, 5 μm)；流動(dòng)相：V(乙腈)∶V(水)=10∶90；柱溫：30 ℃；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)：218 nm；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：20 μL。

質(zhì)譜條件：掃描模式：負(fù)離子場(chǎng)掃描；離子源：電噴霧離子源(ESI)；離子源溫度：500 ℃；電噴霧電壓：4 500 V；霧化氣壓力：0.28 MPa；氣簾氣壓力：0.21 MPa；輔助氣壓力：0.28 MPa；掃描范圍：m/z100～600。

1.3.6 統(tǒng)計(jì)分析

對(duì)于每組處理，均設(shè)置3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，將來(lái)自獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)組合并通過平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差計(jì)算。使用SPSS軟件通過方差分析(ANOVA)和Duncan的多范圍檢驗(yàn)(P<0.05)分析所有數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)工作液HPLC檢測(cè)結(jié)果，DON的保留時(shí)間為15 min左右，以DON進(jìn)樣濃度為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程為Y=18 835x-5 291.1，R2=0.999 9，在0.1～20.0 μg/mL范圍類線性關(guān)系良好(圖1)。

圖1 ClO2處理前后的DON純品HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of DON pure product before and after ClO2 treatment

2.1 ClO2對(duì)DON純品的影響

用不同濃度ClO2溶液對(duì)DON純品進(jìn)行處理，DON的降解率隨ClO2濃度的提高以及處理時(shí)間的延長(zhǎng)而提高。如圖1-a所示，在處理時(shí)間為12 h的條件下，50 mg/L ClO2溶液處理DON純品，降解率只有2.37%，當(dāng)ClO2溶液濃度為150 mg/L時(shí)，降解曲線斜率最大，降解率增長(zhǎng)速度最快，之后逐漸減小，當(dāng)ClO2溶液質(zhì)量濃度達(dá)到600 mg/L時(shí)，降解率為28.23%，當(dāng)ClO2溶液濃度達(dá)到1500 mg/L時(shí)，降解率僅為31.97%，降解率增長(zhǎng)幅度較小，說明降解曲線逐步趨向平穩(wěn)，降解率提升緩慢。如圖1-b所示，ClO2溶液為質(zhì)量濃度600 mg/L，處理12 h后降解率為28.23%，處理48 h后降解率提升至38.51%，說明延長(zhǎng)時(shí)間可以在一定程度上增強(qiáng)對(duì)DON的降解效果，但與通過提高ClO2濃度來(lái)提高降解率相比，延長(zhǎng)時(shí)間的效果提升不太明顯。因此，綜合經(jīng)濟(jì)效益及降解效果來(lái)看，確定最佳ClO2溶液質(zhì)量濃度為600 mg/L，處理時(shí)間為12 h。

a-處理12 h后不同濃度ClO2對(duì)DON的降解;b-不同濃度ClO2在不同處理時(shí)間下對(duì)DON的降解圖2 不同處理對(duì)DON降解的影響Fig.2 Different treatments on DON

2.2 ClO2對(duì)玉米乙醇發(fā)酵糟液的影響

由于ClO2的氧化性較強(qiáng)，為了防止過高濃度ClO2溶液以及過長(zhǎng)的處理時(shí)間影響玉米乙醇發(fā)酵糟液的營(yíng)養(yǎng)成分，結(jié)合ClO2對(duì)DON純品的降解效果，選取質(zhì)量濃度50.0、100.0、150.0、300.0、600.0 mg/L的ClO2溶液對(duì)玉米乙醇發(fā)酵糟液處理12 h。結(jié)果如圖3所示，隨著ClO2質(zhì)量濃度的增加，玉米乙醇發(fā)酵糟液中DON的降解率逐步提升，當(dāng)ClO2濃度為100 mg/L時(shí)，降解曲線斜率最大；600.0 mg/L的ClO2溶液對(duì)其處理12 h后，玉米乙醇發(fā)酵糟液中DON含量由13.013 μg/mL降低至7.167 μg/mL，降解率達(dá)40.70%，降解效果較好。說明該方法能在一定程度上去除玉米乙醇發(fā)酵糟液中的DON。

圖3 不同質(zhì)量濃度ClO2對(duì)玉米發(fā)酵糟液中DON處理12 h的降解效果Fig.3 Degradation effect of DON in wet corn distillersgrains by different concentrations of ClO2 for 12 h注：不同字母表示不同處理組差異顯著(P <0.05)。下同。

2.3 pH值對(duì)DON純品降解的影響

根據(jù)pH值測(cè)定結(jié)果顯示，600 mg/L ClO2溶液pH值為3.71，而玉米乙醇發(fā)酵糟液的pH值為4.82。本文研究了pH值對(duì)DON降解的影響實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖4所示，當(dāng)DON所處環(huán)境溶液pH值小于4.5或大于5.5時(shí)，降解率偏低；當(dāng)DON所處環(huán)境溶液pH值為4.5～5.5時(shí)，降解效果最佳，降解率最高可達(dá)36.78%，但仍低于玉米乙醇發(fā)酵糟液中40.70%的DON降解率，說明pH值確實(shí)對(duì)DON的降解有一定的影響，但pH值不是導(dǎo)致ClO2溶液對(duì)玉米發(fā)酵糟液中DON的降解效果較好的唯一原因。

圖4 pH值對(duì)DON純品降解的影響。Fig.4 Degradation effect of pure DON in different pH

2.4 降解產(chǎn)物的初步分析

圖5的HPLC-MS圖譜所示，DON的質(zhì)荷比為295.17，經(jīng)600 mg/L ClO2溶液對(duì)DON純品處理12 h后，DON的相對(duì)豐度降低，并產(chǎn)生了2種質(zhì)荷比為238.96和380.90的新物質(zhì)，推測(cè)應(yīng)該是DON的降解產(chǎn)物。一般情況下，氧環(huán)鍵的化學(xué)性質(zhì)較為活潑，容易斷鍵開環(huán)。YOUNG等[25-26]的研究表明，用強(qiáng)氧化劑O3處理單端孢霉烯族毒素時(shí)，O3首先攻擊單端孢霉烯族毒素分子的雙鍵部位，并且此氧化作用的效果與C8位上的基團(tuán)有很大關(guān)系，當(dāng)C8位是酮基時(shí)，所需O3的量更少。ClO2具有與O3分子類似的SP2雜化軌道和“V”型分子構(gòu)型，其在發(fā)揮強(qiáng)氧化作用時(shí)，很有可能出現(xiàn)與O3類似的降解情況[27]。如圖5所示，首先ClO2與DON的雙建結(jié)構(gòu)發(fā)生反應(yīng)，形成ClO2-DON中間復(fù)合物，最后DON在雙鍵處開環(huán)降解。此外，在酸性條件下，強(qiáng)氧化劑可以將環(huán)己酮氧化為己二酸[28]，ClO2水溶液、玉米乙醇發(fā)酵糟液均顯示為酸性，在強(qiáng)氧化劑ClO2作用下也可能在酮基處開環(huán)形成新的降解產(chǎn)物(圖6-d)。

a-降解前；b-降解后圖5 經(jīng)600 mg/L ClO2處理DON純品的HPLC-MS圖譜分析Fig.5 HPLC-MS analysis of DON treated with 600 mg/L ClO2

3 結(jié)論與討論

a-DON分子結(jié)構(gòu)；b-ClO2-DON復(fù)合物；c-DON碳碳雙鍵處開環(huán)降解產(chǎn)物；d-DON酮基處開環(huán)降解產(chǎn)物圖6 ClO2處理DON降解產(chǎn)物分析Fig.6 Analysis of DON degradation products by ClO2 treatment

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，ClO2的確對(duì)DON有一定的降解效果，結(jié)合ClO2對(duì)DON純品以及玉米乙醇發(fā)酵糟液的降解情況來(lái)看，提高ClO2濃度比延長(zhǎng)處理時(shí)間的降解效果更佳，ClO2質(zhì)量濃度為0～600 mg/L時(shí)，DON降解率隨ClO2濃度提升而提高，之后降解率提升緩慢并逐步趨于穩(wěn)定。值得注意的是，處于玉米乙醇發(fā)酵糟液的環(huán)境下，DON的降解效果也較好，推測(cè)是玉米乙醇發(fā)酵糟液中某種條件促使DON的化學(xué)鍵處于活潑狀態(tài)，使其容易開環(huán)降解，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)DON所處環(huán)境pH值為4.5～5.5時(shí)，降解率最高，YOUNG[26]的研究表明，當(dāng)pH值為4～6時(shí)，O3對(duì)DON氧化效果更好；常曉嬌等[23]的研究也顯示，pH 7的中性樣品中ZEN的降解情況優(yōu)于pH 3的酸性樣品。此外，玉米乙醇發(fā)酵糟液中可能含有更活潑的電子接受者，能及時(shí)與斷開的鍵結(jié)合，防止斷開的鍵復(fù)原，以提高降解效果。本文為大規(guī)模去除DON提供了一種新的思路，但目前僅ClO2對(duì)DON的降解做了初步研究，其中的降解原理以及降解產(chǎn)物的具體結(jié)構(gòu)，還有待進(jìn)一步研究。此外，二氧化氯具有廣泛的氧化作用，可能會(huì)降低玉米乙醇發(fā)酵糟液中的營(yíng)養(yǎng)，因此將該DON去毒方法應(yīng)用到實(shí)際中還需要一段時(shí)間。