梁 杰， 趙曉旭， 汪秀妹， 楊志強， 汪少蕓

(1. 莆田學院環(huán)境與生物工程學院， 福建省新型污染物生態(tài)毒理效應與控制重點實驗室， 福建 莆田 351100; 2. 福州大學生物科學與工程學院， 福建 福州 350108)

0 引言

生物活性肽具有抗菌[1]、 抗氧化[2-3]、 抑制肥胖[4]、 抗心血管疾病、 抗癌、 神經(jīng)保護活性、 抗炎癥等多種生理功能[5-9]. 鮑魚是一種營養(yǎng)價值和藥用價值較為全面的優(yōu)質(zhì)動物蛋白， 由于其高蛋白、 低脂肪、低膽固醇的特點， 加上滋味鮮美的口感， 素有“海味之冠”的美譽. 我國海域遼闊， 鮑魚資源豐富. 除鮮活鮑魚外， 罐頭鮑魚、 干鮑魚是鮑魚目前的主要銷售方式， 加工企業(yè)在生產(chǎn)過程中產(chǎn)生大量的內(nèi)臟下腳料， 造成環(huán)境污染. 相關(guān)研究[10]證實， 鮑魚內(nèi)臟蛋白具有較強抗氧化能力， 說明其中含有抗氧化能力的氨基酸序列和活性物質(zhì).

本研究以鮑魚內(nèi)臟蛋白為原料， 通過木瓜蛋白酶酶解得到水解肽， 以水解肽清除·OH、 DPPH、 ABTS自由基能力及還原能力為指標對其進行抗氧化評價， 測定其氨基酸含量并對組成成分進行抗氧化穩(wěn)定性研究， 以期為水產(chǎn)品加工下腳料的開發(fā)利用提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1試驗原料

鮑魚內(nèi)臟蛋白由莆田學院環(huán)境與生物工程實驗室自制； 木瓜蛋白酶購自諾維信(中國)生物技術(shù)有限公司； 其它化學試劑均為國產(chǎn)分析純.

1.1.2儀器設(shè)備

冷凍干燥機(FD-1B-55型, 北京博醫(yī)康實驗儀器公司)； 紫外/可見分光光度計(UV2550， 日本島津公司)； 電熱恒溫鼓風干燥箱(DHG-9030A， 上海精宏實驗設(shè)備有限公司)； 超低溫冰箱(MDF-U333型， 日本三洋公司)； 全自動氨基酸測定分析儀(L-8900型， 日本Hitachi公司)； 高效液相色譜儀(Waters TM 650E， 美國Waters公司).

1.2 試驗方法

1) 水解工藝流程. 蛋白凍干粉攪拌至完全溶解， 調(diào)節(jié)至最適條件， 加酶酶解， 在100 ℃下水浴滅酶10 min. 靜置冷卻后， 以10 000 r·min-1速率離心分離10 min， 移液槍吸取上清液(為酶解液)， 分析測定.

2) 抗氧化活性評價. 參照文獻[11]的方法測定·OH自由基清除率； 參照文獻[12]的方法測定ABTS自由基清除率和DPPH自由基清除率； 參照文獻[13]采用鐵氰化鉀法測定還原力.

3) 相對分子質(zhì)量分布測定. 采用HPLC法測定水解肽相對分子質(zhì)量的分布情況， 由儀器自帶的M32工作站軟件自動處理數(shù)據(jù).

4) 氨基酸組成分析. 參照Wang等[14]的方法， 采用全自動氨基酸測定分析儀進行測定.

2 結(jié)果與分析

2.1 鮑魚水解肽的抗氧化活性評價

按照水解工藝流程， 將足量的酶解液進行真空冷凍干燥， 得到鮑魚源水解肽凍干粉， 供后續(xù)實驗使用. 評價抗氧化能力主要通過以下方法測定： ① 清除自由基能力的大小， 如清除羥基自由基、 ABTS自由基、 超氧陰離子自由基、 DPPH自由基、 氮自由基能力, 以及氧自由基吸收能力大小等； ② 測定其還原能力大小[15].

2.1.1·OH自由基清除能力

通過考察不同質(zhì)量濃度鮑魚水解肽對·OH自由基清除率來研究它的抗氧化清除效果. 結(jié)果如圖1(a)所示， 在水解肽質(zhì)量濃度為0～1.0 mg·mL-1時， 對·OH自由基的清除率隨著質(zhì)量濃度增加呈迅速遞增的趨勢， 表明水解肽質(zhì)量濃度與·OH自由基的清除率密切相關(guān)； 水解肽質(zhì)量濃度為1.0 mg·mL-1時， ·OH自由基清除率可達(64.26±0.33)%， 具有較強抗氧化能力； 當水解肽質(zhì)量濃度為1.0～4.0 mg·mL-1時， ·OH自由基清除率的增長趨勢開始趨于平緩， 表明質(zhì)量濃度升高到一定范圍， 水解肽抗氧化能力趨于飽和并維持穩(wěn)定的狀態(tài). 其IC50值(對·OH自由基清除率達到50%時所需的抗氧化劑質(zhì)量濃度)為0.74 mg·mL-1.

2.1.2ABTS自由基清除能力

不同質(zhì)量濃度的水解肽清除ABTS自由基的能力如圖1(b)所示， 水解肽對ABTS自由基的IC50值為0.031 mg·mL-1. 水解肽質(zhì)量濃度為0.02～0.08 mg·mL-1時， ABTS自由基清除率快速增長； 濃度繼續(xù)增加， ABTS自由基清除率增長減慢， 水解肽抗氧化能力接近極限.

2.1.3DPPH自由基清除能力

不同質(zhì)量濃度水解肽清除DPPH自由基的能力如圖1(c)所示， 其IC50值為0.48 mg·mL-1， IC50值與抗氧化能力密切相關(guān)， 其值越小， 表明其清除DPPH自由基的能力越強. 當水解肽質(zhì)量濃度在0.2～1.0 mg·mL-1時， DPPH自由基清除率加快增長， 當水解肽質(zhì)量濃度為1.0 mg·mL-1時， DPPH自由基清除率為(80.26±0.79)%； 此后水解肽質(zhì)量濃度在1.0～5.0 mg·mL-1時， 對DPPH自由基的清除率卻不再升高， 此時水解肽能夠結(jié)合的DPPH自由基趨于飽和狀態(tài).

2.1.4還原力測定

體系中樣品吸光度越大， 還原能力越強， 抗氧化能力也就越強. 可以通過測定還原能力來評價試樣抗氧化能力的強弱， 測試結(jié)果如圖1(d)所示， 鮑魚水解肽的還原能力隨著質(zhì)量濃度的升高不斷增加. 在水解肽質(zhì)量濃度為0.2～4.0 mg·mL-1時， 其還原力的增加與質(zhì)量濃度呈正相關(guān). 通過關(guān)系曲線計算可得， 其IC50值為2.91 mg·mL-1.

圖1 抗氧化活性評價Fig.1 Antioxidant activity evaluation

2.2 水解肽組成成分分析及營養(yǎng)評價

2.2.1水解肽復合物的相對分子質(zhì)量分布測定

采用HPLC法測定水解肽的相對分子質(zhì)量， 結(jié)果如圖2所示. 相對分子質(zhì)量在107 ～ 10 031 u呈連續(xù)分布， 主要分布在180～3 000 u， 占比52.29%； 其中相對分子質(zhì)量<5 000 u的水解肽占比82.00%； 相對分子質(zhì)量>10 000 u的成分相對較少， 為2.13%. 表明木瓜蛋白酶酶解較為完全， 水解物中主要含小片段多肽.

圖2 水解肽成分分析

表1 鮑魚水解肽中氨基酸組成及含量

2.2.2氨基酸組成成分分析

氨基酸營養(yǎng)價值高低主要取決于3個因素： ① 蛋白質(zhì)中是否全面含有各種必需氨基酸； ② 必需氨基酸數(shù)量多少； ③ 必需氨基酸的比例是否符合標準[16-17]. 鮑魚水解肽中氨基酸含量及組成如表1所示， 由18種氨基酸組成， 種類相對齊全， 氨基酸總量高達82.05%， 其中人體必需的8種氨基酸含量為39.30%， 占氨基酸總量47.89%. 含量最高的為蘇氨酸， 其次為異亮氨酸、 天冬氨酸和甘氨酸等. 蘇柳智等[18]對鮑魚臟器醇溶性物質(zhì)的營養(yǎng)分析結(jié)果中， 含量最高的氨基酸為谷氨酸， 其次為蘇氨酸、 丙氨酸和天冬氨酸. 本試驗結(jié)果與上述研究結(jié)果存在不同， 是由于鮑魚品種和生長環(huán)境以及所處生長期不同對蛋白質(zhì)中氨基酸組成有較大影響. 其中酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)占總氨基酸的8.21%， 堿性氨基酸(精氨酸、 賴氨酸、 組氨酸)占總氨基酸的6.41%. 疏水性氨基酸(蛋氨酸、 色氨酸、 苯丙氨酸、 纈氨酸、 亮氨酸、 異亮氨酸、 脯氨酸和丙氨酸)占總氨基酸的53.08%. 蛋氨酸(Met)、 蘇氨酸(Thr)、 色氨酸(Trp)、 組氨酸(His)是公認的抗氧化氨基酸， 其衍生物及含有這些氨基酸的多肽也具有良好的抗氧化能力， 周雪松等[19]研究表明， 亮氨酸(Leu)、 丙氨酸(Ala)、 脯氨酸(Pro)等氨基酸以及含有這些的小肽具有較好的抗氧化能力. 以上抗氧化氨基酸在鮑魚臟器氨基酸中百分含量為34.25%， 它們是鮑魚水解肽具有較強抗氧化能力的主要因素.

2.2.3鮑魚水解肽營養(yǎng)評價

對氨基酸組成進行分析， 參照李華等[20]的評價方法， 以雞蛋白為標準蛋白， 以聯(lián)合國糧農(nóng)組織和世界衛(wèi)生組織(FAO/WHO)建議的氨基酸需要模式為標準， 綜合評價鮑魚水解肽營養(yǎng)價值. 化學評分(amino acid or chemical score， CS)和氨基酸評分(amino acid score， AAS)如表2所示， 受第一限制氨基酸影響， 鮑魚水解肽的化學評分和氨基酸評分均低于FAO/WHO模式和雞蛋模式， 其中氨基酸評分為31.4， 較為接近FAO/WHO模式. 由表2可知， 除第一限制氨基酸、 Phe+Tyr 、 Lys外， 鮑魚水解肽中其余氨基酸含量均遠高于FAO/WHO模式和雞蛋模式. 針對以上特征， 在實際應用過程中， 搭配與之互補的原料配方， 解決Met、 Cys、 Phe、 Tyr的欠缺問題， 以期開發(fā)出營養(yǎng)價值豐富而全面的功能食品.

表2 鮑魚臟器水解肽的氨基酸評分和化學評分

注：*代表第一限制氨基酸

2.3 水解肽抗氧化穩(wěn)定性研究

由于抗氧化肽作為功能食品在加工、 生產(chǎn)、 儲存的過程中會受到各種外界條件， 如環(huán)境溫度、 pH值、 金屬離子等條件變化的影響， 且在人體吸收過程中， 經(jīng)過復雜的胃腸道消化吸收環(huán)境， 其多肽序列及空間構(gòu)象發(fā)生改變， 影響抗氧化肽的功能結(jié)構(gòu)， 因此， 研究水解肽的抗氧化穩(wěn)定性具有重要實際意義.

2.3.1溫度對抗氧化穩(wěn)定性的影響

圖3 溫度對抗氧化肽穩(wěn)定性的影響Fig.3 Effect of temperature on antioxidant peptide stability

水解肽在20～100 ℃下分別恒溫水浴一定時間后， 其抗氧化穩(wěn)定性的保持情況如圖3所示. 當溫度在20～60 ℃時， 水浴時間由2 h延長到5 h， 水解肽清除DPPH自由基能力變化幅度并不明顯； 當溫度升高到80～100 ℃時， 水解肽的DPPH自由基清除活性顯著降低(P<0.05)， 且隨著時間的延長繼續(xù)降低， 當環(huán)境溫度為100 ℃處理5 h后， DPPH自由基保持率只剩(30.54±0.91)%. 由此可知， 鮑魚水解肽的抗氧化能力在20～60 ℃保持良好的穩(wěn)定性， 其抗氧化穩(wěn)定性處于在(97.77±0.43)%的較高水平； 當溫度繼續(xù)提高到80 ℃時， DPPH自由基保持率開始急速下降， 且隨著時間的延長而加劇這一變化反應.

2.3.2pH值對抗氧化穩(wěn)定性的影響

水解肽在pH值為2～12的條件下反應一定時間后， 其抗氧化穩(wěn)定性的保持情況如圖4所示. 當水解肽處于中性和偏堿性條件(pH值為7， 8， 10)反應3～5 h， DPPH自由基保持率基本維持在恒定水平； 處于偏酸性或偏堿性條件會較大地影響水解肽的抗氧化能力， 強堿性條件下(pH=12)影響更為顯著(P<0.05)； 水解化肽在pH值為12的條件下反應3 h后， 其DPPH自由基保持率為(63.32±0.56)%， 反應5 h后， DPPH自由基保持率為(58.37±0.87)%. 水解肽抗氧化能力在強堿條件下顯著減弱， 可能是因為肽鏈氫供體上的氫在強堿條件下被消耗而降低其抗氧化能力， 也可能是因為肽發(fā)生消旋作用引起肽鏈構(gòu)象改變而降低活性[21].

2.3.3金屬離子對抗氧化穩(wěn)定性的影響

向反應體系中添加一定質(zhì)量濃度的金屬離子， 其抗氧化穩(wěn)定性的保持情況如圖5所示， 隨著質(zhì)量濃度的增加， 不同金屬離子對DPPH自由基的影響都逐漸增強， 影響的大小排列為： Cu2+>Zn2+>Ca2+>Mg2+>K+. 當Cu2+的質(zhì)量濃度為500 μg·mL-1時， DPPH自由基保持率僅為(21.03±0.27)%.

圖4 pH值對抗氧化肽穩(wěn)定性的影響Fig.4 Effect of pH value on antioxidant peptide stability

圖5 金屬離子對抗氧化肽穩(wěn)定性的影響Fig.5 Effect of metal on antioxidant peptide stability

2.3.4胃腸道蛋白酶對抗氧化穩(wěn)定性的影響

體外模擬胃腸道消化， 經(jīng)過胃蛋白酶消化5 h后， DPPH自由基清除能力僅能保持在(66.03±0.29)%， 比先前有所降低； 經(jīng)胰蛋白酶消化5 h后， 其DPPH自由基保持率在(109.03±0.57)%， 抗氧化效果有所提高. 這可能是由于胃蛋白酶的特異性作用位點為蘇氨酸和色氨酸的氨基端， 經(jīng)胃蛋白酶水解后原本具有抗氧化能力的肽段被水解為氨基酸殘基而使抗氧化活性降低； 胰蛋白酶的特異性位點為精氨酸和賴氨酸的羧基端， 水解肽經(jīng)胰蛋白酶的作用后具有抗氧化能力的基團被酶解而暴露出來[16].

3 結(jié)語

研究以鮑魚內(nèi)臟蛋白為原料， 采用酶解技術(shù)制備抗氧化水解肽. 該水解肽具有較強的自由基清除能力和還原力， 其主要成分為小片段多肽， 相對分子質(zhì)量在107～10 031 u； 在20～60 ℃范圍內(nèi)， 溫度和時間對水解肽抗氧化性影響不大， 當溫度超過80 ℃時， 抗氧化性隨著溫度和時間增加而明顯降低； 隨著金屬離子質(zhì)量濃度的增加， 水解肽抗氧化性總體呈現(xiàn)下降趨勢， 其中Cu2+的影響最為顯著； 經(jīng)胃蛋白酶消化明顯降低了水解肽抗氧化性， 而胰蛋白酶消化則提高了其抗氧化效果.