王 磊，秦靈靈，穆曉紅，徐暾海，劉銅華

（1.北京中醫(yī)藥大學第三附屬醫(yī)院 北京 100029；2.北京中醫(yī)藥大學科技處 北京 100029；3.北京中醫(yī)藥大學東直門醫(yī)院 北京 100102；4.北京中醫(yī)藥大學中藥學院 北京 100029；5.北京中醫(yī)藥大學教育部中醫(yī)養(yǎng)生學重點實驗室 北京 100029）

在經(jīng)濟、文化、科技蓬勃發(fā)展的當今社會，不健康的生活方式也日益流行。飲食結(jié)構(gòu)不合理、作息時間無規(guī)律、缺乏體育鍛煉、心理力過大、過度吸煙飲酒，以及生態(tài)環(huán)境污染等不良因素，使糖脂代謝紊亂飆升，成為世界范圍的流行性現(xiàn)象，給患者及其家庭、乃至整個社會造成沉重的負擔。其中，高糖高脂、缺乏運動等不健康生活方式導致的脂肪肝等人群占據(jù)很大比重。因此，我們在提高人們的健康意識、提倡健康的生活方式的同時，有必要對脂代謝紊亂患者進行早期有效干預(yù)。在脂質(zhì)代謝過程中，肝臟細胞扮演著非常重要的角色，肝細胞脂肪沉積為脂肪肝等疾病發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，因此，改善肝細胞內(nèi)脂肪代謝是治療脂代謝紊亂的重要途徑。目前治療肝臟脂質(zhì)代謝紊亂的藥物以降脂藥、保肝抗炎、胰島素增敏劑、微生態(tài)制劑、抗氧化劑等為主[1]，但缺乏特效藥物。近年來，中藥改善肝臟脂代謝紊亂的優(yōu)勢逐漸顯現(xiàn)。

番石榴（Psidium guajava Linn）是桃金娘科（Myrtaceae）番石榴屬植物，原產(chǎn)地為南美洲，約17世紀末傳入中國，目前主要栽培于華南各地以及四川西南部。番石榴葉為番石榴木的干燥葉及帶葉嫩枝，別名那拔葉、番桃葉、雞矢茶等。實驗室對其提取出多種有效成分，包括酚酸類，黃酮類，三萜類，倍半萜類等，動物或細胞實驗發(fā)現(xiàn)番石榴葉提取物可以不同程度降低體質(zhì)量、調(diào)節(jié)脂代謝、胰島保護、增加肝臟糖原合成、改善骨骼肌胰島素抵抗、抑制α-葡萄糖苷酶、心腎靶器官保護等作用[2]。其中調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝是其重要作用之一。目前對其分子機制、作用通路和具體靶點缺乏深入研究。前期研究發(fā)現(xiàn)番石榴葉提取物可以顯著降低SHRSP.ZF大鼠體重、降低血清脂聯(lián)素（Adiponectin，APN）、游離脂肪酸（Free fatty acids，F(xiàn)FA）含量、改善糖耐量，并且可緩解肝臟脂肪蓄積的作用【3,4】。AMPK是細胞內(nèi)的能量感受器，主要通過調(diào)控脂肪、蛋白質(zhì)與糖合成與轉(zhuǎn)化，維持細胞內(nèi)能量代謝平衡?，F(xiàn)已證明AMPK的活性降低與肝細胞內(nèi)脂質(zhì)的堆積密切相關(guān)[5]，起關(guān)鍵樞紐作用。近年來，有研究表明番石榴苷是番石榴葉降糖調(diào)脂作用的主要成分之一。本實驗建立在已取得的研究結(jié)果基礎(chǔ)上，觀察番石榴苷對油酸誘導的肝細胞脂質(zhì)沉積細胞模型脂質(zhì)沉積的影響，并且從AMPK為中心，尋找其上下游作用靶點。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

H4ⅡE大鼠肝癌細胞株（ECACC，Lot No．081015，歐洲），高糖DMEM、胎牛血清(FBS)(GIBCO，美國)，油酸(oleic acid，OA，Nacalai Tesque，日本)；兔抗AMPK抗體、兔抗ACC抗體、兔抗P-AMPK(Thrl72)抗體、兔抗PACC(Ser79)抗體(CST，美國)，Blocking One、p-Blocking One、Striping buffer(Nacalai Tesque，日本)，TG檢測試劑盒(Wako，Lot DK.226，日本)，蛋白含量檢測試劑盒(Bio-rad，美國)，ECL 發(fā)光顯色試劑盒(wako，日本)，Compound C(Santacruz，美國)，Sepasol-RNA I Super G(Nacalai Tesque,Kyoto)，ReverTra Ace qPCR RT Kit(Toyobo)。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞模型建立方法

將H4ⅡE細胞接種于含有10%FBS的高糖DMEM(4.5g·L-1glucose)培養(yǎng)基的60 mm細胞培養(yǎng)皿中，在37℃、5%CO2環(huán)境中培養(yǎng)，細胞生長至90%左右時用0.25%胰酶1：3消化、傳代。將40 mmol·L-1的油酸與高塘培養(yǎng)基配制成終濃度為0.2 mmol·L-1的油酸脂質(zhì)誘導培養(yǎng)基液，將生長至80%-90%匯合的H4ⅡE細胞按照3×105個細胞/ml的密度接種至60 mm培養(yǎng)皿中，約24 h后，待孔中H4ⅡE細胞生長至80%左右匯合時，加入3 mL誘導液，24 h后細胞模型建立，用于后續(xù)實驗。

1.2.2 細胞生存率的影響

將HEⅡ4細胞接種于96孔板，接種密度為4000個/孔，設(shè)為6個組，分別為空白組，不同濃度GAN(0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mM)給藥組，每組設(shè)置5個復孔。各組培養(yǎng)72 h后，每孔加入10 ul的MTT試劑(5 mg·mL-1)，繼續(xù)培養(yǎng)3 h，每孔加入100 μL的DMSO。在570 nm吸光度下測定各孔OD值，計算細胞生存率=OD檢體/OD空白對照。

1.2.3 甘油三酯(TG)測定

分為空白組、模型組、不同濃度給藥組（0.05、0.1、0.3 mM）。空白組用低糖培養(yǎng)基培養(yǎng)；模型組、GAN給藥組細胞在達到80%左右匯合時，換上誘導液，24 h后，GAN給藥組分別加入不同濃度GAN,24 h后收集細胞，使用DCTM法進行蛋白定量，按照GPO·DAOS法測定細胞內(nèi)甘油三酯。用TG／蛋白含量評估細胞內(nèi)脂質(zhì)沉積。

1.2.4 阻滯劑處理

分為空白組、模型組、GAN給藥組、及阻滯劑-GAN給藥組?？瞻捉M細胞一直用低糖培養(yǎng)基培養(yǎng)；模型組、GAN給藥組、阻滯劑-GAN給藥組細胞在達到80%左右匯合時，換上誘導液誘導24 h，阻滯劑-GAN給藥組加0.02 mmol·L-1Compound C處理l h后，與GAN給藥組均加入GAN，上述各組細胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h，其后按照1.2.3的方法測定TG／蛋白含量。

1.2.5 Western blotting法檢測AMPK、P-AMPK(Thr172)、ACC、P-ACC（Ser79）蛋白的表達量

實驗隨機分為模型組、GAN給藥組（0.3 mM），按照1.2.1方法建立細胞模型后，GAN給藥組加入GAN共同培養(yǎng)24 h后取出，在冰上用Homogenized buffer提取細胞內(nèi)蛋白，分別用10%-12．5%SDS．PAGE分離膠，5%濃縮膠分離蛋白，然后電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，轉(zhuǎn)移后分別用Blocking One、p-Blocking One封閉30 mim后用1∶1000稀釋的兔抗AMPK抗體、兔抗ACC抗體以及兔抗P-AMPK(Thr172)、兔抗P-ACC（Ser79）抗體，4℃過夜后，TBS洗膜3次×10 min后用1∶10000稀釋的辣根過氧化物酶標記的二抗室溫振蕩孵育1 h，TBS洗膜3次，10 min／次。此后用ECL發(fā)光顯色試劑盒顯影成像，圖像經(jīng)掃描后用NIH ImageJ軟件進行光密度分析。計算AMPK的磷酸化水平=P-AMPK(Thr172)/AMPK，ACC磷酸化水平=P-ACC（Ser79）/ACC。

1.2.6 實時熒光定量PCR法檢測AdipoR 1、AdipoR 2mRNA表達量

圖1 番石榴苷對HEⅡ4細胞存活率的影響（n=5）

圖2 番石榴苷對HEⅡ4細胞內(nèi)甘油三酯的影響(n=3)

圖3 -1番石榴苷對AMPK磷酸化水平的影響(n=3)

按照1.2.5方法處理培養(yǎng)細胞后，①提取總RNA：采用Sepasol-RNA I Super G提取總RNA，采用核酸紫外分光光度計檢測所獲RNA濃度與純度；②引物序列 ：AdipoR1 forward，TGAGGTACCAGCCAGATGTC；AdipoR1 reverse，CGTGTCCGCT TCTCTGTTACPPAR；內(nèi)參基因β-actin forward,GGGAAATCGT GCGTGACATT，β-actin reverse,，GCGGCAGTGGCCATCTC；③RNA 的體外反轉(zhuǎn)與Real-Time PCR：經(jīng)25μL反轉(zhuǎn)錄體系，將所得的cDNA加入20μL Real-Time PCR體系，95℃預(yù)變性 1min，95℃ 15 s、60℃ 32 s、95℃ 15 s、60℃ 20 s、95℃for 15 s 40個循環(huán)(ABI Prism 7000)，用內(nèi)參基金校正RNA表達量。

1.2.7 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 17．0分析軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料采用均值±標準差(±s)表示，用組間比較用單因素方差分析法（組別數(shù)大于等于3），或獨立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 實驗結(jié)果

2.1 番石榴苷對HEⅡ4細胞存活率的影響

用MTT法觀察番石榴在終濃度為（0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mM）時對正常細胞生長的影響。結(jié)果顯示劑量大于0.3 mM時藥物對細胞生長有明顯影響（圖1）。

2.2 番石榴苷對HEⅡ4細胞內(nèi)甘油三酯的影響

按照GPO·DAOS法對細胞內(nèi)甘油三酯測定顯示，模型組甘油三脂水平明顯高于空白組，具有顯著性差異(P＜0.05)；給藥組與模型組相比，GAN不同濃度對甘油三酯有不同程度的降低，其中濃度為0.3 mM的GAN給藥組與模型組比較具有差異(P＜0.05)。

2.3 番石榴苷對AMPK磷酸化水平的影響

如圖3-1、3-2所示，與模型組相比，濃度為0.3 mM的GAN可顯著增加AMPK的磷酸化水平(P＜0.05)

2.4 番石榴苷對ACC磷酸化水平的影響

如圖4-1、4-2所示，與模型組相比，GAN可顯著增加ACC的磷酸化水平(P＜0.05)

2.5 番石榴苷對AMPK阻滯劑Compound C作用后細胞內(nèi)TG的影響

由圖5可以看出，模型組與空白組相比具有顯著性差異(P＜0.05)；GAN給藥組與模型組比較具有差異(P＜0.05)，阻滯劑-GAN給藥組與GAN給藥組比較有顯著差異(P＜0.05)，即GAN降低細胞內(nèi)TG含量的作用被AMPK阻滯劑Compound C所逆轉(zhuǎn)。由此說明GAN降低肝細胞脂質(zhì)堆積模型中TG含量的作用與激活A(yù)MPK有關(guān)。

2.6 番石榴苷對AdipoR 1 mRNA表達的影響

與模型組相比，GAN可顯著增加AdipoR 1mRNA表達量(P ＜ 0.05)（圖6）。

圖3 -2 番石榴苷對AMPK、P-AMPK(Thr172)表達的影響(n=3)

圖4 -1番石榴苷對ACC磷酸化水平的影響(n=3)

3 討論

胰島素抵抗(Insulin Resistance,IR)是導致糖脂代謝紊亂的主要因素之一,是多種代謝相關(guān)疾病發(fā)生的“共同土壤”,如糖耐量減退、高血壓、中心性肥胖、血脂代謝紊亂、動脈粥樣硬化等。腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)信號途徑是研究胰島素抵抗、肥胖、2型糖尿病等代謝性疾病的關(guān)鍵通路。AMPK作為一種重要的蛋白激酶參與機體的多種代謝過程，可調(diào)控能量代謝、脂肪代謝、蛋白質(zhì)代謝、糖代謝等。

AMPK是細胞能量代謝的感受器,其活性受到許多因素的調(diào)控。這些因素主要與細胞ATP的消耗和抑制調(diào)節(jié)有關(guān)，由AMP/ATP的比例來控制。AMPK可被5'AMP別構(gòu)激活以及被磷酸肌酸別構(gòu)抑制，也可被其上游的AMPK激酶(AMPKkinase inase，AMPKK)激活，兩者的作用位點都是AMPK-α亞基172位蘇氨酸[6]。AMPK由具有催化作用的α亞基和具有調(diào)節(jié)作用的β和γ亞基組成。α亞基上的蘇氨酸172(Thr172)為AMPK的主要活性位點，當Thr172磷酸化時，AMPK被激活。激活的AMPK可以使下游脂肪酸合成的關(guān)鍵酶乙酰CoA羧化酶(ACC)磷酸化失活，抑制脂肪合成。侯祥紅對體外培養(yǎng)的人體肝癌細胞HepG2，添加不同濃度的共軛亞麻酸(Conjugated linoleic acid，CLA)，結(jié)果表明隨著共軛亞麻酸濃度升高，增加了HepG2細胞的脂質(zhì)沉積，機理可能是與AMPKα磷酸化水平逐漸下降、伴隨乙酰輔酶A羧化酶(Acetyl-CoA arboxylase，ACC)表達水平升高有關(guān)[7]。王瑾通過棕櫚酸鈉和大麻素Ⅰ型受體抑制劑處理Hep-2細胞，發(fā)現(xiàn)AMPK磷酸化后,能夠使線粒體的氧化作用增強，發(fā)揮減脂作用[8]。

圖4 -2 番石榴苷對ACC、P-ACC（Ser79）表達的影響(n=3)

圖5 番石榴苷對AMPK阻滯劑Compound C作用后細胞內(nèi)TG的影響(n=3)

圖6 番石榴苷對AdipoR 1mRNA表達量的影響(n=3)

除此以外，脂聯(lián)素(adiponectin，APN)、瘦素(leptin)、運動等也可激活A(yù)MPK[9]。APN是脂肪細胞分泌的一種細胞因子,與APN受體(AdipoRs)結(jié)合后,激活自身發(fā)揮生物學特性。在肝臟中，APN能抑制脂肪酸轉(zhuǎn)運蛋白表達，促進脂肪酸氧化，減少肝糖異生原料[10]。APN受體(AdipoRs)主要有APN受體1(AdipoR 1)、APN受體2(AdipoR 2)兩種受體，AdipoR 1在各組織中廣泛表達，AdipoR 2主要在肝臟表達。有研究表明高糖狀態(tài)下，APN與AdipoR 1結(jié)合，可以激活下游的靶因子AMPK，并逐級發(fā)生反應(yīng)，增強脂肪酸氧化，減少脂肪在組織中的堆積[11,12,13]。脂聯(lián)素可以抑制SREBP1c表達，調(diào)控肝細胞脂肪合成，可能是通過AdipoR1/LKB1/AMPK通路實現(xiàn)的。也有研究發(fā)現(xiàn)脂聯(lián)素可以激活小鼠肌肉細胞中AMPK及PPAγ活性，同時促進aco、cpt1和fabp3表達量，從而提高肌肉細胞中脂肪氧化水平。對雞脂肪細胞的研究中發(fā)現(xiàn)，可以通過激活A(yù)MPK/ACC2通路抑制雞脂肪細胞的脂肪合成[14]。

番石榴葉味甘澀，性平、入脾、胃、肝、大腸經(jīng)，有清熱解毒、燥濕健脾的功效，在我國民間，常用于治療糖尿病，腸炎痢疾，創(chuàng)傷出血等疾病。臨床上，我國廣西和日本均進行過臨床對照觀察，顯示番石榴葉可以明顯改善糖調(diào)節(jié)受損患者的空腹血糖，可顯著降低血清胰島素水平及胰島素抵抗指數(shù)(homeostasis model assessment-insulin resistance index，HOMA-IR)。藥理實驗研究顯示，番石榴葉及其提取物具有調(diào)節(jié)脂代謝、胰島保護、增加肝臟糖原合成、改善骨骼肌胰島素抵抗、抑制α-葡萄糖苷酶、心腎靶器官保護等一系列作用[2]。也有研究[14]發(fā)現(xiàn)，番石榴葉提取物可顯著降低小鼠腹部脂肪系數(shù)、血糖，同時，不同劑量番石榴葉之間存在一定的劑量效應(yīng)關(guān)系。郭翔宇等[2]研究發(fā)現(xiàn)番石榴葉提取物可以顯著降低SHRSP.Z-Leprfa/IzmDmcr大鼠的體質(zhì)量。能夠通過增加SHRSP.Z-Leprfa/IzmDmcr大鼠骨骼肌脂聯(lián)素受體(AdipoR1)、AMPK表達,激活下游IRS-PI3K-AKTGLUT4信號通路，促使葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白(GLUT4)從胞漿向細胞膜轉(zhuǎn)運，增加葡萄糖攝取，改善胰島素抵抗、從而降低血糖。

本課題組前期實驗觀察番石榴葉提取物對自發(fā)胰島素抵抗肥胖SHRSP/ZF（SHRSP.Z-Leprfa/IzmDmcr）動物模型的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)番石榴葉可減低大鼠體重，降低血清中FFA含量，減輕肝臟內(nèi)脂質(zhì)的沉積，改善糖耐量。在上述實驗結(jié)果基礎(chǔ)上，本實驗以番石榴葉中主要成分番石榴苷為干預(yù)因素，從脂質(zhì)代謝角度出發(fā)，觀察其對油酸誘導大鼠肝臟細胞脂質(zhì)沉積細胞模型的作用，并且從AMPK通路，尋找其上下游作用靶點。H4ⅡE細胞來源于大鼠肝癌細胞株，它保留了肝細胞基本的生理特性。故本實驗選擇油酸誘導的大鼠H4ⅡE細胞建立脂質(zhì)沉積的細胞模型，首次探討番石榴苷對H4ⅡE細胞脂質(zhì)沉積的影響。

本實驗給藥后，番石榴苷可顯著降低脂質(zhì)沉積細胞模型內(nèi)TG含量，并且對細胞內(nèi)AMPK的磷酸化有顯著的激活作用，且其降低細胞內(nèi)TG含量作用可被AMPK阻滯劑所逆轉(zhuǎn)，由此可見番石榴苷改善脂質(zhì)沉積的作用與AMPK的激活密切相關(guān)，進一步觀察發(fā)現(xiàn)番石榴苷同時具有增加AMPK的下游具有抑制脂肪酸合成作用的ACC的磷酸化，以及AMPK上游AdipoR 1的基因表達的作用，由此可以初步推斷番石榴苷可能是通過調(diào)節(jié)AdipoR 1/AMPK/ACC信號通路，調(diào)節(jié)肝細胞內(nèi)脂質(zhì)沉積的，其具體調(diào)節(jié)機制有待進一步探索。但本研究對與有關(guān)改善脂質(zhì)代謝紊亂的新藥研發(fā)具有參考作用。