方宇鵬, 戴啟培

(池州職業(yè)技術(shù)學(xué)院 園林系,安徽 池州 247000)

大別山冬青(IlexdabieshanensisK.Yao & M.B.Deng)，又名霍山冬青，為冬青科(Aquifoliaceae)冬青屬(Ilex)闊葉常綠喬木，是我國(guó)特有的植物,原產(chǎn)于安徽省西部的大別山地區(qū)，在海拔150～470m的溝邊及山坡路邊野生生長(zhǎng)。其果實(shí)紅艷，葉色翠綠，生長(zhǎng)勢(shì)極強(qiáng)，且耐修剪，耐瘠薄干旱，有很強(qiáng)的適應(yīng)性，是珍貴的園林綠化樹種。此外，大別山冬青可制作保健飲料苦丁茶，具有降脂及消炎等藥用保健的功效，有十分廣闊的市場(chǎng)應(yīng)用前景[1,2]。池州職業(yè)技術(shù)學(xué)院于2013年開始對(duì)大別山冬青扦插繁殖進(jìn)行研究，但繁殖系數(shù)低。目前所繁殖植物僅用于苦丁茶制作，園林應(yīng)用尚未有報(bào)道。為開發(fā)推廣利用大別山冬青這一種質(zhì)資源，本文在前人研究的基礎(chǔ)上，運(yùn)用正交試驗(yàn)法，篩選并建立大別山冬青離體快繁體系，以期為實(shí)現(xiàn)大別山冬青工廠化育苗、加快其推廣應(yīng)用等方面提供理論依據(jù)和技術(shù)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為安徽省安慶市太湖縣宏安冬青樹種植農(nóng)民專業(yè)合作社提供的5年生扦插苗。2017年5月中旬取無病蟲害、生長(zhǎng)健壯的當(dāng)年生枝條。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 外植體的消毒處理 用自來水將具有腋芽的一年生枝條沖洗30min，然后去除葉片，留少量葉柄，放入盛有洗衣粉溶液的燒杯中漂洗，并不斷攪動(dòng)，洗凈后瀝干，移至超凈工作臺(tái)上。75%的酒精消毒20s后用無菌水沖洗5次后，再將其放于0.1%的升汞液中消毒8min，然后用無菌水沖洗3～5次，最后將莖段表面的水分用無菌紙吸干[3,4]。最后將經(jīng)過消毒的莖段(外植體)剪切成約0.5～1.0cm長(zhǎng)的莖段，每莖段帶1～2個(gè)腋芽，接種到初代培養(yǎng)基上誘導(dǎo)腋芽萌發(fā)。

1.2.2 腋芽誘導(dǎo)培養(yǎng) 通過L9(33)的正交試驗(yàn)法，將培養(yǎng)基設(shè)計(jì)為9個(gè)不同的組合，最終篩選出最佳大別山冬青的芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基組合。正交試驗(yàn)中所用基本培養(yǎng)基為WPM、B5和MS,細(xì)胞分裂素NAA的質(zhì)量濃度分別設(shè)為0、0.3及0.5mg·L-1,而6-BA的質(zhì)量濃度分別設(shè)為0.5、1.0及1.5mg·L-1。每個(gè)培養(yǎng)瓶中分別接種3個(gè)莖段，每種試驗(yàn)處理分別接種10瓶，重復(fù)三次。外植體接種后置于(23±3)℃，光照2000Lx，16h/d的條件下培養(yǎng)。觀察腋芽的生長(zhǎng)狀況,培養(yǎng)30d后開始統(tǒng)計(jì)各處理的誘導(dǎo)率和其新稍的長(zhǎng)度。利用正交設(shè)計(jì)的相關(guān)軟件助手對(duì)統(tǒng)計(jì)的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，以此篩選大別山冬青最佳的誘導(dǎo)培養(yǎng)基組合。

1.2.3 繼代增殖培養(yǎng) 前期初代培養(yǎng)誘導(dǎo)后產(chǎn)生的新梢，經(jīng)過切割處理后轉(zhuǎn)接到含不同濃度配比生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的增殖培養(yǎng)基中。根據(jù)外植體在不同處理下初代培養(yǎng)基中誘導(dǎo)分化情況，以MS培養(yǎng)基為繼代增殖培養(yǎng)基，并添加6-BA及IBA作為生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，其濃度配比分別為：6-BA設(shè)0.5mg·L-1和1.0mg·L-1，IBA設(shè)0.3mg·L-1和0.5mg·L-1。將經(jīng)過初代培養(yǎng)后的嫩梢進(jìn)行切割，隨機(jī)接種到不同的繼代增殖培養(yǎng)基中，每瓶2個(gè)莖段，各莖段帶一個(gè)新腋芽。每個(gè)處理接種10瓶，重復(fù)三次，培養(yǎng)周期為30d。觀察芽增殖情況，計(jì)算大別山冬青叢生芽增殖率，篩選最佳繼代增殖培養(yǎng)基。

1.2.4 生根培養(yǎng) 將長(zhǎng)至3～4cm高的健壯大別山冬青試管苗接種到4種生根培養(yǎng)基上進(jìn)行生根誘導(dǎo)：(1)1/2MS+NAA0.1mg·L-1+IBA1.0mg·L-1；(2)1/2MS+NAA0.1mg·L-1+IBA0.5mg·L-1；(3)1/2MS+NAA0.5mg·L-1+IBA1.0mg·L-1；(4)1/2MS+NAA0.5mg·L-1+IBA0.5mg·L-1。觀察根系生長(zhǎng)情況，40d統(tǒng)計(jì)生根率，從中篩選最佳生根培養(yǎng)基。

1.2.5 煉苗移栽 大別山冬青生根后的組培苗株高4cm左右時(shí)可進(jìn)行煉苗與移栽。選擇根系發(fā)達(dá)、生長(zhǎng)健壯的組培苗，先將瓶蓋打開，覆上保鮮膜在人工氣候室內(nèi)放2～3d。再從培養(yǎng)瓶中取出小苗，洗除根部的培養(yǎng)基，移栽至消毒過的泥炭土、珍珠巖和蛭石混合的基質(zhì)中。前期適當(dāng)遮陰，保持一定的濕度，25d后統(tǒng)計(jì)成活率。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

利用Excel作圖后進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和處理，方差分析采用SPSS18.0軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)基及生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑濃度對(duì)初代培養(yǎng)的影響

大別山冬青接種15d后，各處理腋芽均有一定程度的膨大，25d后觀察發(fā)現(xiàn)有腋芽萌發(fā)。由表1中數(shù)據(jù)可見，三個(gè)因素中(細(xì)胞分裂素NAA的質(zhì)量濃度、基本培養(yǎng)基和6-BA的質(zhì)量濃度)，影響大別山冬青生長(zhǎng)及其腋芽萌發(fā)的主要因素為6-BA質(zhì)量濃度的高低，基本培養(yǎng)基種類影響次之，而細(xì)胞分裂素NAA的質(zhì)量濃度對(duì)初代培養(yǎng)影響最小。此外，由表1可知，大別山冬青腋芽萌發(fā)率及新稍的生長(zhǎng)隨著6-BA質(zhì)量濃度的升高，呈先增加后降低的趨勢(shì)。三種培養(yǎng)基對(duì)大別山冬青腋芽的萌發(fā)都具有一定的誘導(dǎo)作用，但其中WPM培養(yǎng)基的誘導(dǎo)效果不明顯。通過不同的試驗(yàn)處理及結(jié)果分析可見，大別山冬青腋芽誘導(dǎo)最佳的培養(yǎng)基為MS+6-BA1.0mg·L-1+NAA0.3mg·L-1，其腋芽誘導(dǎo)率高達(dá)100%。

表1 培養(yǎng)基及生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)大別山冬青腋芽的誘導(dǎo)影響

2.2 不同質(zhì)量濃度的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)大別山冬青繼代培養(yǎng)的影響

將大別山冬青初代培養(yǎng)后的新芽通過繼代接種到增殖培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中含不同濃度的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑。通過繼代培養(yǎng)30d后，對(duì)叢生芽的增殖情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同濃度的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合對(duì)大別山冬青叢生芽增殖的影響差異顯著。

由表2分析可見，大別山冬青經(jīng)初代培養(yǎng)后的嫩枝接種在不同質(zhì)量濃度的IBA和6-BA配比的MS培養(yǎng)基上時(shí)，隨著6-BA質(zhì)量濃度的升高，大別山冬青的增殖系數(shù)呈升高趨勢(shì)。當(dāng)IBA質(zhì)量濃度為0.5mg·L-1時(shí)，增殖效果不明顯。當(dāng)6-BA質(zhì)量濃度為1.0mg·L-1、IBA質(zhì)量濃度為0.3mg·L-1時(shí)，增殖效果最好，與其它處理間呈顯著差異。因此，大別山冬青叢生芽增殖的最佳培養(yǎng)基為MS+6-BA1.0mg·L-1+IBA0.3mg·L-1。

2.3 大別山冬青組培苗生根培養(yǎng)

將高3～4cm健壯生長(zhǎng)的大別山冬青試管苗分別接種到含不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的生根培養(yǎng)基中進(jìn)行誘導(dǎo)生根處理。培養(yǎng)15d后觀察可發(fā)現(xiàn)，大別山冬青組培苗開始產(chǎn)生不定根；25d后可見大量須根。由表3可見，不同質(zhì)量濃度的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑NAA和IBA可在一定程度上誘導(dǎo)大別山冬青組培苗生根。但當(dāng)NAA質(zhì)量濃度為0.1mg·L-1，IBA質(zhì)量濃度為0.5mg·L-1時(shí)，生根率相對(duì)較低，生根所需時(shí)間長(zhǎng)，平均根長(zhǎng)短，不定根數(shù)量較少；隨著生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑NAA的質(zhì)量濃度增加，大別山冬青的生根率及不定根的數(shù)量呈升高趨勢(shì)，且最長(zhǎng)根長(zhǎng)和平均根長(zhǎng)也逐漸增加。當(dāng)生根培養(yǎng)基中添加0.3mg·L-1的NAA和0.2mg·L-1的IBA時(shí)，大別山冬青的組培苗誘導(dǎo)生根率高達(dá)95%，不定根數(shù)量達(dá)6.8條，平均根長(zhǎng)達(dá)2.6cm，不定根數(shù)量及平均根長(zhǎng)均與其他處理間差異顯著。因此，從綜合生根率及根系質(zhì)量可知，最適宜大別山冬青組培苗生根的培養(yǎng)基是1/2MS+NAA0.3mg·L-1+IBA0.2mg·L-1。

表2 不同質(zhì)量濃度的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)大別山冬青繼代增殖的影響

注：增殖系數(shù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，其中差異顯著(p<0.05)以小寫字母表示。下同

Notes：The multiplication coefficient is average value ± standard deviation.The significant difference(p<0.05)was expressed in different lower letters

表3 生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑濃度對(duì)大別山冬青組培苗根的誘導(dǎo)影響

2.4 大別山冬青組培苗馴化移栽

大別山冬青生根后的組培苗長(zhǎng)至4cm高時(shí)，將根系發(fā)達(dá)、生長(zhǎng)健壯的組培苗，經(jīng)馴化后移栽至消毒過的蛭石(V)：珍珠巖(V)：泥炭土(V)按2:1:2混合的基質(zhì)中，控制外界環(huán)境條件，移栽后25d，植物長(zhǎng)勢(shì)良好，成活率可達(dá)85%。

3 結(jié)論與討論

大別山冬青是園林綠化中一種珍貴的優(yōu)良樹種，在保健飲料中還可制作為苦丁茶，具很好的降脂、消炎等保健和藥用功效，有很好的的市場(chǎng)開發(fā)效益及廣闊的應(yīng)用前景。通過對(duì)大別山冬青的組織培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行研究，可快速增加大別山冬青的繁殖系數(shù)，對(duì)大別山冬青種質(zhì)資源的利用及創(chuàng)新應(yīng)用有重要意義。目前，市場(chǎng)上大別山冬青主要通過扦插進(jìn)行繁殖,但扦插繁殖系數(shù)較低，且受生長(zhǎng)季節(jié)等外界環(huán)境條件影響[5,6]。為提高大別山冬青在園林綠化中的應(yīng)用范圍及藥用生產(chǎn)價(jià)值,急需通過其它高效育苗途徑提高其繁殖率。組織培養(yǎng)技術(shù)可在很大程度上提高繁殖系數(shù),培養(yǎng)體系建立后,通過組培技術(shù)可在短時(shí)間內(nèi)獲得大批量?jī)?yōu)質(zhì)的種苗[7,8],這對(duì)豐富我省綠化樹種、推動(dòng)大別山冬青的園林應(yīng)用及苦丁茶制作有極大的意義。但目前，大別山冬青組培技術(shù)鮮有報(bào)道。本項(xiàng)目采用大別山冬青當(dāng)年生嫩枝莖段為外植體進(jìn)行組培快繁，探索出大別山冬青離體快繁體系,以此技術(shù)手段為后期大別山冬青的推廣應(yīng)用及開發(fā)提供了有效的試驗(yàn)依據(jù)和技術(shù)指導(dǎo)，促進(jìn)了大別山冬青這一優(yōu)質(zhì)樹種的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，在生產(chǎn)上具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

在植物的組培過程中，選擇適宜的培養(yǎng)基對(duì)大別山冬青的誘導(dǎo)分化及器官的再生培養(yǎng)有重要作用。因此，以MS、B5、WPM為基本培養(yǎng)基，通過正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)不同的培養(yǎng)基組合，篩選出最適宜大別山冬青腋芽誘導(dǎo)的培養(yǎng)基。試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用WPM培養(yǎng)基作為基本培養(yǎng)基時(shí)，腋芽的誘導(dǎo)率較低；采用MS培養(yǎng)基作為基本培養(yǎng)基時(shí)，誘導(dǎo)率較高，且其他指標(biāo)也優(yōu)于WPM及B5培養(yǎng)基。這與前人在木本植物組織培養(yǎng)中的研究較為一致[9-12]。作為廣泛使用的MS培養(yǎng)基，其微量元素齊全，硝態(tài)氮和銨態(tài)氮含量相對(duì)較高，而WPM及B5培養(yǎng)基中銨態(tài)氮含量低，硝態(tài)氮含量則較高[13]，高比例的銨態(tài)氮和硝態(tài)氮可能對(duì)大別山冬青的誘導(dǎo)分化有一定促進(jìn)作用。

植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑種類、配比及濃度在植物的離體快繁中，也對(duì)外植體的誘導(dǎo)分化有很大影響[14]。向培養(yǎng)基中添加不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)外植體的內(nèi)源激素水平有一定的影響，因此不同濃度生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑及配比的培養(yǎng)基對(duì)外植體誘導(dǎo)分化能力產(chǎn)生明顯影響[15]。本試驗(yàn)在初代培養(yǎng)中，選擇不同的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，腋芽萌發(fā)情況差異較大。隨著NAA質(zhì)量濃度的升高，大別山冬青腋芽萌發(fā)率呈先增高后降低趨勢(shì)；而隨著6-BA質(zhì)量濃度的增加，腋芽萌發(fā)率的變化無明顯規(guī)律。通過正交試驗(yàn)，結(jié)果可得知，以MS+6-BA1.0mg·L-1+NAA0.3mg·L-1作為培養(yǎng)基是最適宜腋芽誘導(dǎo)的培養(yǎng)基，其腋芽萌發(fā)率高，新稍生長(zhǎng)快?？梢?，在組織培養(yǎng)過程中，植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)促進(jìn)細(xì)胞伸長(zhǎng)生長(zhǎng)有一定的作用。

試驗(yàn)中，通過觀察發(fā)現(xiàn)，基部愈傷組織在外植體腋芽萌發(fā)時(shí)形成。將其處理后進(jìn)行增殖培養(yǎng)的同時(shí)，在原培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)原外植體。后期基部產(chǎn)生的愈傷組織，使其繼續(xù)培養(yǎng)萌發(fā)新芽。但5次繼代后，基部不再有愈傷組織形成，莖段上也不再有新的腋芽萌發(fā)。該現(xiàn)象與冬青莖段的組織培養(yǎng)研究結(jié)果一致[16,17]。試驗(yàn)結(jié)果表明，外植體基部愈傷組織的形成與腋芽的萌發(fā)有一定的關(guān)系。在增殖培養(yǎng)過程中，發(fā)現(xiàn)6-BA誘導(dǎo)效果優(yōu)于IBA，在30d內(nèi)，可使增殖系數(shù)高達(dá)3.6。但是在繼代過程中，發(fā)現(xiàn)隨著繼代次數(shù)的增加，部分愈傷組織出現(xiàn)褐化，導(dǎo)致大別山冬青愈傷組織褐化的原因很多，可能與外界的環(huán)境條件、培養(yǎng)基種類及狀態(tài)、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑種類及類型等有關(guān)，具體原因有待于進(jìn)一步試驗(yàn)研究。

試驗(yàn)結(jié)果表明，1/2MS培養(yǎng)基中添加生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑可誘導(dǎo)大別山冬青組培苗生根。吳月燕等[18]研究發(fā)現(xiàn)：IBA質(zhì)量濃度在一定的范圍內(nèi)，IBA質(zhì)量濃度對(duì)內(nèi)源IAA的含量有影響，并隨著IBA質(zhì)量濃度的增加呈升高趨勢(shì)[18]；外源NAA則對(duì)內(nèi)源IAA的合成有促進(jìn)作用，對(duì)促進(jìn)根的形成有一定作用[19]。本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，隨著NAA質(zhì)量濃度的增加，生根率逐漸增加。但相同質(zhì)量濃度NAA條件下，IBA質(zhì)量濃度過高，生根率反而下降?？梢?，大別山冬青組培苗生根情況與生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑種類及質(zhì)量濃度配比有一定的關(guān)系。

通過本試驗(yàn)研究，建立了以莖段作為外植體的大別山冬青組培快繁技術(shù)體系，得出大別山冬青初代培養(yǎng)最佳培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基，且添加6-BA1.0mg·L-1+NAA0.3mg·L-1是最適宜腋芽誘導(dǎo)的培養(yǎng)基。繼代增殖培養(yǎng)則以MS+6-BA1.0mg·L-1+IBA0.3mg·L-1最適宜,增值系數(shù)最高。組培苗生根培養(yǎng)基以1/2MS+NAA0.3mg·L-1+IBA0.2mg·L-1最宜，生根率達(dá)95%，根系發(fā)達(dá)。經(jīng)生根后的試管苗移栽至蛭石(V)：珍珠巖(V)：泥炭土(V)=2:1:2混合基質(zhì)，控制環(huán)境條件，成活率可達(dá)85%。本試驗(yàn)研究建立的大別山冬青組培快繁體系，為加快大別山冬青的推廣應(yīng)用奠定了重要的技術(shù)基礎(chǔ)。