陳青連，姚 振，馮 雅

（杭州澳亞生物技術(shù)有限公司，浙江 杭州 310018）

苯磺順阿曲庫(kù)銨為神經(jīng)肌肉阻滯劑，可在運(yùn)動(dòng)終板上與膽堿能受體結(jié)合，拮抗乙酰膽堿，從而產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)性的神經(jīng)肌肉傳導(dǎo)阻滯作用。本品由GaxoWellcome公司（葛蘭素）于1996年首次在英國(guó)上市，商品名為賽機(jī)寧（Nimbex）。根據(jù)《注射劑安全性檢查法應(yīng)用指導(dǎo)原則》，靜脈用注射劑均應(yīng)設(shè)立細(xì)菌內(nèi)毒素（或熱原）檢查項(xiàng)［1］，該品種及其注射劑已收載于2015年版《中國(guó)藥典（四部）》。國(guó)內(nèi)常采用凝膠法對(duì)注射用苯磺順阿曲庫(kù)銨進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查研究，國(guó)際通行光度法，而我國(guó)凝膠法使用較普遍，且2015年版《中國(guó)藥典》也以凝膠法結(jié)果為準(zhǔn)［2］。本研究中采用凝膠法對(duì)苯磺順阿曲庫(kù)銨注射液進(jìn)行了細(xì)菌內(nèi)毒素方法學(xué)研究?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

XH-D型渦旋混合器（上海允延儀器有限公司）；N10型試管恒溫儀（杭州奧盛儀器有限公司）。

1.2 試藥

苯磺順阿曲庫(kù)銨（TEVA，批號(hào)為4014AO00117R，規(guī) 格 為 原 料 ）；苯 磺 酸 （Sigma-Aldrich，批 號(hào) 為BCBR4713V，規(guī)格為輔料）；苯磺順阿曲庫(kù)銨注射液（杭州澳亞生物技術(shù)有限公司，批號(hào)為分別17121311，17121411，17121511，規(guī)格為每支 5 mL ∶10 mg）。細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品（WSE，湛江安度斯生物有限公司，批號(hào)為 1708160，規(guī)格為 10 EU）；鱟試劑（TAL；批號(hào)分別為1607291 和 1704072、靈敏度為 0.25 EU ／mL，批號(hào)分別為 1705243 和 1612283、靈敏度為 0.125 EU ／mL，批號(hào)為1712252、靈敏度為0.06 EU／mL，湛江安度斯生物有限公司；批號(hào)為 17031712、靈敏度為 0.25 EU ／mL，批號(hào)為 17060412、靈 敏 度 為 0.125 EU／mL，批 號(hào) 為17070112，靈敏度為 0.06 EU ／mL；福州新北生化工業(yè)有限公司）；細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水（WBET，批號(hào)為1608010，規(guī)格為 5 mL），稀釋劑Ⅰ（BufferⅠ，批號(hào)為1702210，規(guī)格為4.0 mL），均購(gòu)于湛江安度斯生物有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 預(yù)試驗(yàn)

苯磺順阿曲庫(kù)銨注射液由苯磺順阿曲庫(kù)銨、苯磺酸、注射用水組成。為苯磺順阿曲庫(kù)銨注射液細(xì)菌內(nèi)毒素檢查鱟試劑靈敏度的選擇提供參考，分別采用不同廠家靈敏度為0.25 EU／mL的鱟試劑對(duì)苯磺順阿曲庫(kù)銨及苯磺酸進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查，其中苯磺順阿曲庫(kù)銨細(xì)菌內(nèi)毒素限值參考原料廠家（TEVA）為4.94 EU／mg，苯磺酸細(xì)菌內(nèi)毒素限值暫定為10 EU／mg。采用不同廠家靈敏度為0.25 EU／mL的鱟試劑對(duì)苯磺酸細(xì)菌內(nèi)毒素進(jìn)行檢查，結(jié)果均符合規(guī)定；采用湛江安度斯生物有限公司0.25 EU／mL的鱟試劑對(duì)苯磺順阿曲庫(kù)銨細(xì)菌內(nèi)毒素進(jìn)行檢查，供試品陽(yáng)性對(duì)照平行管均呈陰性，結(jié)果不符合規(guī)定。改用靈敏度為0.125 EU／mL的鱟試劑進(jìn)行檢查，試驗(yàn)結(jié)果均符合規(guī)定。

根據(jù)細(xì)菌內(nèi)毒素驗(yàn)證方法學(xué)指導(dǎo)原則，注射用藥品、生物制品建立細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法時(shí)，為驗(yàn)證不同樣品和不同鱟試劑反應(yīng)的一致性，要求同時(shí)使用2個(gè)廠家的鱟試劑對(duì)每個(gè)品種至少3批樣品進(jìn)行干擾試驗(yàn)，以確定該品種是否對(duì)內(nèi)毒素和鱟試劑的反應(yīng)存在干擾作用，以及能否使用內(nèi)毒素檢查法進(jìn)行檢驗(yàn)。綜合考慮，擬采用靈敏度為0.125 EU／mL的鱟試劑對(duì)苯磺順阿曲庫(kù)銨注射液進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素干擾試驗(yàn)。

2.2 鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)Ⅰ

根據(jù)2015年版《中國(guó)藥典（四部）》相關(guān)規(guī)定，當(dāng)使用新批號(hào)的鱟試劑時(shí)，應(yīng)進(jìn)行鱟試劑的靈敏度復(fù)核試驗(yàn)。用 WBET 將 WSE 稀釋成 2.0，1.0，0.5，0.25 λ 系列濃度后進(jìn)行試驗(yàn)。結(jié)果表明，所用各批鱟試劑的復(fù)核靈敏度（λC）為 0.5 ～ 2.0 λ，可用于細(xì)菌內(nèi)毒素檢查。詳見(jiàn)表1。

表1 鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)結(jié)果Ⅰ

2.3 細(xì)菌內(nèi)毒素限值（L）的確定

公式為L(zhǎng)＝K／M，其中L為供試品的細(xì)菌內(nèi)毒素限值，一般以EU／mg表示；K為人每1 kg體質(zhì)量每1 h最大可接受的內(nèi)毒素劑量，以EU／（kg·h）表示，注射劑K＝5EU／（kg·h）；M為人用每1 kg體質(zhì)量每1 h的最大供試品劑量，以mg／（kg·h）表示。根據(jù)苯磺順阿曲庫(kù)銨注射液原研藥品說(shuō)明書(shū)中的用法用量“按靜脈輸注給藥，2 g／L 的順阿曲庫(kù)銨最大劑量為 9.0 μg ／（kg·min），即0.54 mg ／（kg·h）?！庇?jì)算確定L＝9.26 EU ／mg。為保證藥品質(zhì)量及用藥安全，應(yīng)不高于臨床用藥計(jì)算的最大限制（9.26 EU／mg），故確定苯磺順阿曲庫(kù)銨注射液L值與2015年版《中國(guó)藥典（二部）》注射用苯磺順阿曲庫(kù)銨質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中細(xì)菌內(nèi)毒素的限值一致，即為3.0 EU／mg。

2.4 干擾預(yù)試驗(yàn)Ⅰ

供試品最小有效稀釋濃度計(jì)算：根據(jù)L值確定最小有效稀釋濃度（C）公式為C＝λ／L。其中，C為最小有效稀釋濃度；λ為在凝膠法中鱟試劑的標(biāo)示靈敏度。本驗(yàn)證方案擬采用標(biāo)示靈敏度為0.125 EU／mL的鱟試劑，L為 3.0 EU ／mg，C＝ λ ／L＝0.042 g／L。

試驗(yàn)方法：將供試品用WBET稀釋至質(zhì)量濃度為0.680，0.340，0.170，0.085，0.042 g／L，此系列質(zhì)量濃度溶液記為NPC。同時(shí)在上述試驗(yàn)液中加入細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，使每個(gè)質(zhì)量濃度的試驗(yàn)液中均含2 λ濃度的細(xì)菌內(nèi)毒素，此系列溶液記為PPC。取2.2項(xiàng)下2個(gè)廠家靈敏度為0.125 EU／mL的鱟試劑各64支，分別與上述2個(gè)系列溶液反應(yīng)，每個(gè)濃度重復(fù)2管。每批鱟試劑作陰性對(duì)照（NC）和陽(yáng)性對(duì)照（PC）。干擾預(yù)試驗(yàn)Ⅰ結(jié)果見(jiàn)表2?？梢?jiàn)，苯磺順阿曲庫(kù)銨注射液質(zhì)量濃度為0.042 g／L時(shí)，對(duì)2個(gè)廠家的鱟試劑均無(wú)干擾作用，因此，正式干擾試驗(yàn)時(shí)，采用供試品質(zhì)量濃度為0.042 g／L的溶液。

表2 干擾預(yù)試驗(yàn)Ⅰ結(jié)果

2.5 正式干擾試驗(yàn)Ⅰ

結(jié)果見(jiàn)表3?？梢?jiàn)，WBET配制的內(nèi)毒素溶液反應(yīng)終點(diǎn)濃度的幾何平均值（Es）在 0.5 ～ 2.0 λ（包括 0.5 λ和 2.0 λ）時(shí)，0.042 g／L 的供試品溶液 3 批供試品的Et值均不在 0.5 ～ 2.0Es（包括 0.5Es 和 2.0Es）范圍內(nèi)，表明供試品在此質(zhì)量濃度下有較強(qiáng)的干擾作用。當(dāng)供試品對(duì)鱟試劑凝膠形成有影響時(shí)，為減少假陰性結(jié)果，可采用靈敏度小于 0.125 EU ／mL 的鱟試劑［3］。

表3 正式干擾試驗(yàn)Ⅰ結(jié)果

2.6 鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)Ⅱ

對(duì)標(biāo)示靈敏度為0.06 EU／mL的鱟試劑進(jìn)行復(fù)核，結(jié)果表明所用各批鱟試劑的復(fù)核靈敏度λC均為0.5～2.0 λ，可用于細(xì)菌內(nèi)毒素檢查。詳見(jiàn)表4。

表4 鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)結(jié)果Ⅱ

2.7 干擾預(yù)試驗(yàn)Ⅱ

采用標(biāo)示靈敏度為0.06 EU／mL的鱟試劑，最小有效稀釋質(zhì)量濃度C＝0.02 g／L。將供試品用WBET稀釋至質(zhì)量濃度為 0.32，0.16，0.08，0.04，0.02 g／L，同2.4項(xiàng)下方法操作，取2.2項(xiàng)下2個(gè)廠家靈敏度為0.06 EU／mL的鱟試劑各64支，分別與上述2個(gè)系列溶液反應(yīng)，每個(gè)濃度重復(fù)2管，每批鱟試劑作NC和PC。干擾預(yù)試驗(yàn)結(jié)果符合標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定。采用靈敏度0.06 EU／mL的鱟試劑對(duì)苯磺順阿曲庫(kù)銨注射液進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素方法學(xué)驗(yàn)證，干擾預(yù)試驗(yàn)結(jié)果表明，供試品對(duì)鱟試劑與內(nèi)毒素的反應(yīng)有較強(qiáng)的抑制作用。補(bǔ)充適量的二價(jià)離子可有效消除苯磺順阿曲庫(kù)銨對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素檢查的抑制作用［4］。采用稀釋劑Ⅰ替代WBET制備供試品，預(yù)試驗(yàn)結(jié)果符合標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定。

2.8 干擾預(yù)試驗(yàn)Ⅲ

以稀釋劑Ⅰ替代WBET制備供試品，按2.6項(xiàng)下方法對(duì)供試品進(jìn)行梯度稀釋，采用靈敏度為0.06 EU／mL的鱟試劑對(duì)3批苯磺順阿曲庫(kù)銨注射液進(jìn)行干擾預(yù)試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表5?？梢?jiàn)，供試品溶液質(zhì)量濃度為0.02 g／L時(shí)對(duì)2個(gè)廠家的鱟試劑均無(wú)干擾。

2.9 正式干擾試驗(yàn)Ⅱ

結(jié)果見(jiàn)表 6?？梢?jiàn)，Es在 0.5 ～2.0 λ（包括 0.5 λ 和2.0 λ）時(shí)，質(zhì)量濃度為 0.02 g／L 的供試品溶液 3 批供試品的Et值在 0.5 ～2.0Es（包括 0.5Es和 2.0Es）范圍內(nèi)，確認(rèn)供試品在此濃度下無(wú)干擾作用。

2.10 供試品檢驗(yàn)

取3批供試品各1瓶，用稀釋劑Ⅰ按上述方法分別配制成質(zhì)量濃度為0.02 g／L的供試品溶液，以靈敏度為0.06 EU／mL的鱟試劑依法檢查。結(jié)果見(jiàn)表7。

表5 干擾預(yù)試驗(yàn)Ⅲ結(jié)果

表6 正式干擾試驗(yàn)Ⅱ結(jié)果

表7 供試品檢驗(yàn)結(jié)果

3 討論

2015年版《中國(guó)藥典》熱原物質(zhì)檢查有家兔檢查法與細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法［5-6］，前者試驗(yàn)靈敏度低、周期長(zhǎng)、重復(fù)性差、檢測(cè)成本高。與家兔檢查法相比，細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法具有檢測(cè)靈敏度高、重復(fù)性好、檢測(cè)成本低、結(jié)果準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)［7-8］。用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法代替熱原法也符合動(dòng)物試驗(yàn)學(xué)的3R原則，故今后會(huì)得到廣泛應(yīng)用［9］。

目前，細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法使用較多的是凝膠限度法與動(dòng)態(tài)濁度法。凝膠限度法無(wú)法對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素進(jìn)行定量，僅根據(jù)是否超過(guò)限值作出判斷。動(dòng)態(tài)濁度法可通過(guò)反應(yīng)曲線來(lái)獲得細(xì)菌內(nèi)毒素的量。隨著國(guó)內(nèi)外藥品質(zhì)量及安全性的提高，內(nèi)毒素定量檢測(cè)是大勢(shì)所趨［10-11］。

苯磺順阿曲庫(kù)銨注射液的細(xì)菌內(nèi)毒素理論限值為9.26 EU／mg，《化學(xué)藥品注射劑安全性檢查法應(yīng)用指導(dǎo)原則》要求限值可適當(dāng)嚴(yán)格至理論限值的 1 ／3 ～1 ／2［12］，參考2015年版《中國(guó)藥典》注射用苯磺順阿曲庫(kù)銨質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)“每1 mg順阿曲庫(kù)銨含內(nèi)毒素的量應(yīng)小于3.0 EU”，因此采用內(nèi)毒素限值L為3.0EU／mg進(jìn)行研究。2015年版《中國(guó)藥典》要求供試品pH為6.0～8.0。且有學(xué)者認(rèn)為，鱟試劑對(duì)供試品有一定的緩沖能力［13］。苯磺順阿曲庫(kù)銨注射液的pH為3.0～3.8，經(jīng)WBET稀釋后，pH約為6.0，故本試驗(yàn)無(wú)須使用輔助試劑（如稀釋劑Ⅱ）對(duì)供試品pH進(jìn)行調(diào)節(jié)。

稀釋劑Ⅰ是一種輔助劑，含有一定濃度的二價(jià)離子，可飽和枸櫞酸鹽的螯合反應(yīng)，維持鱟試劑的正常靈敏度，并有較強(qiáng)的pH緩沖能力，使反應(yīng)介質(zhì)保持反應(yīng)所需的最佳pH。有研究中使用稀釋劑Ⅰ制備供試品溶液，有效地消除了其對(duì)鱟試劑與內(nèi)毒素的抑制作用［14-15］。在以WBET制備苯磺順阿曲庫(kù)銨注射液供試品溶液時(shí)，正式干擾試驗(yàn)結(jié)果表明，苯磺順阿曲庫(kù)銨對(duì)鱟試劑與內(nèi)毒素的凝集反應(yīng)有較強(qiáng)的抑制作用。由表5可見(jiàn)，以稀釋劑Ⅰ代替 WBET，供試品溶液在 0.02 g／L時(shí)對(duì)2個(gè)廠家的鱟試劑均無(wú)干擾作用。正式干擾試驗(yàn)用0.02 g／L供試品稀釋液及2個(gè)廠家的鱟試劑，結(jié)果Es均為 0.5 ～ 2.0 λ（包括 0.5 λ 和 2.0 λ），Et為 0.5 ～ 2.0Es（包括 0.5Es和 2.0Es），說(shuō)明苯磺順阿曲庫(kù)銨注射液在該濃度下無(wú)干擾作用。因此，可用凝膠法對(duì)苯磺順阿曲庫(kù)銨注射液進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查。