許銘洙，楊 勇，郭振東，嚴(yán)鴻林,*，張宏福，劉靜波,

（1.西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，四川綿陽621010；2.軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院軍事獸醫(yī)研究所，吉林長春1301222；3.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，動(dòng)物營養(yǎng)學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100193）

在封閉式豬舍中，豬排泄物和飼料等霧化形成的氣溶膠可導(dǎo)致飼養(yǎng)人員和動(dòng)物呼吸道發(fā)生疾病，而氣溶膠中的微生物被認(rèn)為是引起上述問題的主要原因[1-2]。前人研究表明，豬舍氣溶膠中的微生物主要來源于豬糞便[3]，且豬舍氣溶膠和豬糞便的微生物組成具有極大的相似性[4-5]。因此，豬舍氣溶膠的微生物組成可能由豬糞便微生物決定。

豬的糞便微生物組成受諸多因素影響，特別是生長階段。Kim 等[6]和Niu 等[7]研究表明，豬糞便微生物結(jié)構(gòu)隨豬生長階段變化而變化，保育豬和育肥豬糞便微生物組成差異極大?；谪i糞便和豬舍氣溶膠微生物組成的相似性，因而推測(cè)保育豬舍和育肥豬舍氣溶膠微生物組成可能存在差異。此外，Hong 等[8]研究發(fā)現(xiàn)，豬舍、雞舍及火雞舍氣溶膠中四環(huán)素類抗性基因豐度存在顯著差異，與抗生素的使用量和頻次有關(guān)。在養(yǎng)豬生產(chǎn)中，保育豬抗生素使用量和頻次遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于育肥豬。因此，本研究采用RT-qPCR 方法比較保育舍和育肥舍特定微生物和四環(huán)素類抗性基因豐度，旨在探明2 個(gè)生長階段豬舍氣溶膠微生物組成和抗性基因豐度差異，將為進(jìn)一步探明畜禽舍氣溶膠的形成機(jī)制提供參考和積累資料。

1 材料與方法

1.1 豬舍空氣樣品采集與處理 試驗(yàn)于貴州省某豬場(chǎng)選擇8 個(gè)保育舍和8 個(gè)育肥舍進(jìn)行采樣，豬舍大小均為36 m×9 m×3.5m（長×寬×高），采用隧道式通風(fēng)，安有2 個(gè)換氣風(fēng)扇，舍內(nèi)通風(fēng)良好，濕度在60% 左右。保育舍內(nèi)2 列共24 個(gè)豬欄飼養(yǎng)480 頭左右杜×長×大仔豬，育肥舍2 列共24 個(gè)豬欄飼養(yǎng)200 頭左右杜×長×大育肥豬。豬只自由采食和飲水，飼料為普通粉狀料，人工清糞早晚各1 次。將大容量空氣采樣器（華瑞核安，HRHA01-LFS120D/A）置于2 列豬欄中間走廊中央離地1 m 處，采集所有保育舍和育肥舍的空氣樣品。每個(gè)豬舍的空氣樣品于08：00 和18：00 分別采集2 次。采樣濾膜為石英膜，采樣后將膜置于冰上并及時(shí)運(yùn)送到實(shí)驗(yàn)室。將每個(gè)豬舍采集空氣樣品的濾膜剪碎并混合后轉(zhuǎn)入離心管中，加入無菌的超純水，置于冰上震蕩20 min，使膜上的氣溶膠顆粒充分洗脫溶解。將得到的洗脫液于21 000 ×g 低溫離心10 min，棄掉上清液，剩余的氣溶膠顆粒置于-20℃保存待測(cè)。

1.2 豬舍氣溶膠DNA 提取 采用UltraClean?Soil DNA Isolation Kit（MoBio Labratories, Carlsbad，CA）提 取豬舍氣溶膠顆粒的總DNA。所有提取步驟按照說明書進(jìn)行?？侱NA 的濃度和純度采用NanoDrop ND-1000（Nanodrop Technologies， Thermo Scientific，Wilmington，DE，USA）測(cè)定。本試驗(yàn)中16 個(gè)豬舍氣溶膠顆?？侱NA 的OD260/OD280在1.85～1.97。樣品總DNA 的質(zhì)量采用2% 瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。

1.3 RT-qPCR 測(cè)定微生物組成 參照Bergstr?m 等[9]和Liu 等[10]的方法，檢測(cè)8 個(gè)保育舍和8 個(gè)育肥舍的氣溶膠中特定微生物類群的豐度。本試驗(yàn)測(cè)定了豬舍氣溶膠中總菌（Universe）、厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、梭菌綱（Clostridia）、乳桿菌屬（Lactobacillus）、普雷沃氏菌屬（Prevotella）、擬桿菌屬（Bacteroides）、瘤胃球菌屬（Ruminococcus）、羅氏菌屬（Roseburia）、羅伊氏乳桿菌（Lactobacillus reuteri）、約翰遜氏乳桿菌（Lactobacillus johnsonii）、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）的豐度。引物序列見表1。采用11 μL 熒光定量PCR 反應(yīng)體系： 2 μL DNA，2.7 μL無核酸酶水，上、下游引物各0.4 μL（10 μmol/L）和5.5 μL 2×KAPA SYBR FAST qPCR Kit Master Mix。反 應(yīng)條 件 ：50℃2min，95℃10min，40 個(gè)循環(huán)變性/退火（95℃ 15 s，60℃1 min）和熔解曲線過程（70℃至90℃，每5 s 上升0.5℃）。熒光定量反應(yīng)在ABI7600 儀器上進(jìn)行。從ABI7600 的數(shù)據(jù)軟件SDS 中導(dǎo)出每個(gè)孔ΔRn 的數(shù)據(jù)，導(dǎo)入LinregPCR 軟件，分析每個(gè)樣品目的微生物的擴(kuò)增效率，并計(jì)算目的微生物的平均擴(kuò)增效率。結(jié)合每個(gè)目的擴(kuò)增產(chǎn)物的響應(yīng)閾值和平均擴(kuò)增效率，計(jì)算樣品中該目的微生物的起始濃度（N0，specific）。根據(jù)總菌的起始濃度，計(jì)算目的微生物在菌群中的相對(duì)比例（N0，specific/N0，universe）。

1.4 豬舍氣溶膠四環(huán)素類抗性基因的測(cè)定 土霉素等四環(huán)素類抗生素在養(yǎng)豬生產(chǎn)中廣泛使用，因而本研究參照Hong 等[8]的方法測(cè)定豬舍氣溶膠中四環(huán)素類抗性基因TetB、TetH、TetZ、TetO、TetQ 和TetW 的絕對(duì)豐度。本試驗(yàn)構(gòu)建了這些抗性基因的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒DNA，并以重組質(zhì)粒為標(biāo)準(zhǔn)品采用10 倍稀釋梯度（108拷貝數(shù)到100拷貝數(shù)）建立每個(gè)抗性基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線。引物序列見表2。PCR反應(yīng)體系：2 μL DNA，0.5 μL上、下游引物（5 μmol/L），5 μL 2×KAPA SYBR FAST qPCR Kit Master Mix 和2 μL無核酸酶水；反應(yīng)條件：95℃ 10 min，40 個(gè)循環(huán)變性/退火（95℃ 10 s，60℃ 1 min）和熔解曲線過程（60℃至95℃，每5 s 上升0.5℃）。氣溶膠樣品中抗性基因的測(cè)定同樣按照上述反應(yīng)體系和條件進(jìn)行。將樣品某一抗性基因的Cq 值帶入到相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線中計(jì)算出拷貝數(shù)，并計(jì)算每納克 DNA 中該基因的拷貝數(shù)。

表1 熒光定量微生物引物序列

表2 熒光定量四環(huán)素類抗性基因引物序列

1.5 統(tǒng)計(jì)分析 首先采用SAS 9.0 對(duì)微生物相對(duì)豐度數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性和方差齊性檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布的變量采用非配對(duì)t 檢驗(yàn)分析保育舍和育肥舍間的差異顯著性（n=8）；不符合正態(tài)分布的變量采用Mann Whitney U檢驗(yàn)分析保育舍和育肥舍間的差異顯著性（n=8）。

首先對(duì)四環(huán)素類抗性基因絕對(duì)豐度數(shù)據(jù)進(jìn)行Log10轉(zhuǎn)化，采用SAS 9.0 中非配對(duì)t 檢驗(yàn)分析保育舍和育肥舍間的差異顯著性（n=8）。

采用R 軟件對(duì)微生物相對(duì)豐度和四環(huán)素類抗性基因絕對(duì)豐度數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析（PCA），采用prcomp 函數(shù)計(jì)算各主成分的貢獻(xiàn)率，以PC1 和PC2 的坐標(biāo)值并采用ggplot2 功能包作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 保育和育肥豬舍氣溶膠微生物的組成 由圖1 可知，不同豬舍類型氣溶膠微生物組成存在顯著差異。與保育舍相比，育肥舍氣溶膠微生物組中Firmicutes、Lactobacillus、Lactobacillus reuteri 和Lactobacillus johnsonii 豐度顯著提高（P＜0.05），而Bacteroidetes、Clostridia 和Prevotella 豐度顯著降低（P＜0.05）。PCA分析結(jié)果顯示，保育舍和育肥舍的樣品可根據(jù)微生物豐度數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類。在整體水平上，保育舍的微生物組成和育肥舍存在明顯差異（圖2）。

2.2 保育和育肥豬舍氣溶膠四環(huán)素類抗性基因的豐度 由圖3 可知，不同豬舍類型氣溶膠四環(huán)素類抗性基因的絕對(duì)豐度存在差異。與保育舍相比，育肥舍氣溶膠TetB、TetH、TetZ、TetO、TetQ 和TetW 的絕對(duì)豐度均顯著降低（P＜0.05）?；诳顾幓蚩截悢?shù)的PCA 分析顯示，保育舍氣溶膠中抗性基因分布變異性大于育肥舍，不同類型豬舍氣溶膠抗性基因分布存在差異（圖4）。

圖1 生長階段對(duì)豬舍氣溶膠微生物組成的影響

圖2 基于豬舍氣溶膠微生物豐度的主成分分析

圖3 生長階段對(duì)豬舍氣溶膠四環(huán)素類抗性基因豐度的影響

圖4 基于豬舍氣溶膠抗性基因豐度的主成分分析

3 討 論

由于全封閉式豬舍氣溶膠直徑小且質(zhì)量低，易從豬舍轉(zhuǎn)運(yùn)至公共區(qū)域，因而豬舍氣溶膠不僅對(duì)養(yǎng)殖從業(yè)人員健康存在危害，同時(shí)對(duì)公共衛(wèi)生也是一大挑戰(zhàn)。豬糞便中的養(yǎng)分給微生物的繁殖和傳播提供了基礎(chǔ)，是豬舍氣溶膠微生物的主要來源之一[3-5]。本研究對(duì)微生物豐度進(jìn)行PCA 分析發(fā)現(xiàn)，保育舍和育肥舍氣溶膠微生物組成存在明顯差異，在門上，保育舍氣溶膠中Firmicutes低于育肥舍，而Bacteroidetes 高于育肥舍，這與前人研究日齡對(duì)豬糞便微生物影響的結(jié)果一致，即隨著日齡增加Bacteroidetes 逐漸被Firmicutes 取代[6-7]；在屬上，保育舍氣溶膠Prevotella 豐度低于育肥舍，這也與前人研究豬糞便微生物組成的結(jié)果一致[6-7]。前人研究發(fā)現(xiàn)，豬糞便微生物中Lactobacillus 的豐度與日齡和體重正相關(guān)[7,11]。本研究也發(fā)現(xiàn)，育肥舍氣溶膠中Lactobacillus 豐度顯著高于保育舍。此外，本試驗(yàn)比較4 種乳桿菌在保育舍和育肥舍氣溶膠中的豐度差異，發(fā)現(xiàn)Lactobacillus reuteri 和Lactobacillus johnsonii 豐 度在育肥舍氣溶膠中較高。前人研究發(fā)現(xiàn)，Lactobacillus reuteri 和Lactobacillus johnsonii 與動(dòng)物肌肉合成能力正相關(guān)[12]。這2 種菌在育肥舍中豐度較高的原因可能在于育肥豬的肌肉合成能力和肌纖維增長速率大于保育豬。

不同畜禽舍類型對(duì)氣溶膠四環(huán)素類抗性基因豐度有顯著的影響，豬舍中TeH、TeZ 和TeW 的拷貝數(shù)高于蛋雞舍和火雞舍，這與抗生素的使用量和頻次多有關(guān)[8]。養(yǎng)豬生產(chǎn)中，斷奶是仔豬面臨的最大應(yīng)激之一，因而在這一階段抗生素被大量使用[11]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，保育舍氣溶膠所有6 種四環(huán)素類抗性基因的拷貝數(shù)均高于育肥舍，這可能與較多的抗生素用于保育階段有關(guān)。

綜上所述，保育舍和育肥舍氣溶膠微生物在特定門和屬的豐度上存在顯著差異，且保育舍6 種四環(huán)素類抗性基因豐度高于育肥舍。