宋 琪，吳鵬波，譚詩云

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院消化內(nèi)科 消化系統(tǒng)疾病湖北省重點實驗室，武漢 430060)

非酒精性脂肪肝病(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)是西方國家慢性肝病最常見的病因，預(yù)計也將于2030年成為肝移植最常見的指征[1]。自2001年以來，NAFLD已成為世界上慢性肝病的主要病因，由其病程進(jìn)展可分為單純性肝脂肪變、非酒精性脂肪肝炎及肝纖維化[2]，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜多樣，包括胰島素抵抗、脂肪細(xì)胞激素分泌、腸道微生態(tài)改變、營養(yǎng)因素和遺傳因素等[3-5]。肥胖、胰島素抵抗、2型糖尿病和血脂異常是NAFLD最重要的危險因素[6]。在全球范圍內(nèi)的成年人中，NAFLD的發(fā)病率已高達(dá)20%～40%[7]。

依澤替米貝(ezetimibe,Eze)作為一類新型的選擇性膽固醇吸收抑制劑，已有多篇文獻(xiàn)報道了它聯(lián)合他汀類藥物對血清膽固醇水平的降低作用[8-10]。Patel等[11]的研究也表明Eze可改善伴有肝功能損害的NAFLD患者血清膽固醇及肝功能水平。體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)Eze可抑制腸道和肝臟的膽固醇吸收靶點NPC1L1(Niemann-Pick C1-Like 1)，從而降低食物中膽固醇的吸收、降低肝脂肪含量及改善肝臟胰島素敏感性等，進(jìn)而起到治療NAFLD的作用[12]。

自噬，即細(xì)胞自我消化，是細(xì)胞內(nèi)的溶酶體降解細(xì)胞內(nèi)受損的細(xì)胞器、未折疊的蛋白質(zhì)和細(xì)胞內(nèi)的病原體的代謝過程[13-14]。Lee等[15]研究表明，Eze可通過激活Nrf2對高脂飲食誘導(dǎo)的非酒精性脂肪肝炎小鼠起到一定的治療作用，而這個過程與自噬相關(guān)蛋白p62密切相關(guān)。本實驗以油酸(oleic acid,OA)誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞為體外模型[16]，探討Eze對NAFLD細(xì)胞模型脂質(zhì)沉積和凋亡的影響及其與自噬的關(guān)系，為Eze治療NAFLD提供實驗依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料

1.1.1細(xì)胞株和試劑 人肝癌細(xì)胞株HepG2由武漢大學(xué)中南醫(yī)院贈送。Eze購于上海阿拉丁生物公司(產(chǎn)品編號:E126609)；Gibco DMEM/H(Dulbecco′s modified eagle medium/high glucose)培養(yǎng)液購自美國賽默飛世爾公司，NQBB胎牛血清購自澳大利亞Bolise Co.,Ltd.公司；細(xì)胞計數(shù)試劑盒-8(cell counting kit-8，CCK-8)試劑盒、蘇木精染液、Alexa Fluor 488標(biāo)記山羊抗兔IgG、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG、膜聯(lián)蛋白-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶(annexin V-fluorescein isothiocyanate/propidium iodide annexin,V-FITC/PI)凋亡檢測試劑盒和辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG購自上海碧云天生物公司；油紅O、β-肌動蛋白(β-actin)購于北京索萊寶科技有限公司，OA購于美國Sigma公司(貨號:O1383)；Beclin-1和微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(microtubule-associated protein 1 light 3，LC3)抗體購于美國Cell Signaling Technology公司；質(zhì)粒購于上海海吉浩格生物科技有限公司；Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒購于北京康為世紀(jì)有限公司。

1.1.2儀器 THERMOHeracellVIOS 160i/250i CO2培養(yǎng)箱(德國Thermo Scientific公司)，Bio-Rad imark全自動酶標(biāo)儀，Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)ChemiDocTMXRS+，OLYMPUS IX71顯微鏡，OLYMPUS BX53顯微鏡，Bio-Rad電泳儀，流式細(xì)胞儀BD FACS Calibur。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 從液氮罐中取出HepG2細(xì)胞凍存管，置于37 ℃恒溫水浴中于1～2 min內(nèi)迅速解凍，以離心半徑8 cm，1 000 r/min離心4 min后去除凍存液，并用含10%胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)的DMEM完全培養(yǎng)基重懸后移至細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃、含5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。隔日換液，3～5 d后傳代，取處于對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實驗。

1.2.2CCK-8實驗 取對數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞，用完全培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104/mL，接種于96孔板中，每孔加入100 μL細(xì)胞懸液置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。次日按照每組3個復(fù)孔及培養(yǎng)板順序進(jìn)行分組給藥，分為空白對照組、OA組(OA濃度為0.6 mmol/L)、Eze低濃度組(Eze濃度為10 μmol/L)、Eze中濃度組(Eze濃度為20 μmol/L)、Eze高濃度組(Eze濃度為40 μmol/L)，藥物處理36 h后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，孵育1 h用酶標(biāo)儀在 450 nm測定吸光度。增殖率=A實驗組/A空白組×100%。

1.2.3油紅O染色 取對數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞，將細(xì)胞濃度調(diào)整為5×104/mL，接種于24孔板中，每孔加入1 mL細(xì)胞懸液進(jìn)行培養(yǎng)。次日按照是否加入OA、Eze和氯喹(chloroquine,CQ)及培養(yǎng)板順序進(jìn)行分組給藥，分為空白對照組、OA組、OA+Eze組及OA+Eze+CQ組，其中各藥物濃度分別為OA濃度為0.6 mmol/L，Eze濃度為20 μmol/L，CQ濃度為20 μmol/L。藥物處理24 h后，每孔用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline,PBS)洗滌3次，4%多聚甲醛固定30 min，再次用PBS洗滌3次，每孔加入500 μL油紅O染液(提前用雙蒸水以2∶3比例稀釋0.5%油紅O溶液，混勻后靜置30 min，并用直徑為0.22 μm的微孔濾膜過濾)，于37 ℃水浴箱中染色1 h，用75%乙醇洗滌5 s后以蘇木精染核，甘油明膠封片，倒置顯微鏡下觀察脂滴沉積情況。

1.2.4Western blot檢測Beclin-1和LC3表達(dá)水平 取對數(shù)生長期的細(xì)胞接種于6孔板中，每孔加入2 mL完全培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。次日分組給藥(分組同油紅O染色)，藥物處理24 h后提取細(xì)胞蛋白，并用BCA蛋白濃度試劑盒測定蛋白濃度，根據(jù)測得濃度調(diào)整上樣量，將蛋白樣品加入十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，后經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，Tris-HCl+Tween-20緩沖鹽溶液清洗3次(每次5 min)，在一抗溶液中4 ℃孵育過夜，Tris-HCl+Tween-20緩沖鹽溶液清洗3次(每次15 min)后于二抗中37 ℃孵育1 h，TBST清洗3次(每次15 min)，用ECL化學(xué)發(fā)光液浸潤1 min，于凝膠成像系統(tǒng)中掃描成像并計算灰度值。

1.2.5細(xì)胞凋亡實驗(Annexin V-FITC/PI雙染) 將對數(shù)生長期的細(xì)胞用胰酶消化后重懸于完全培養(yǎng)基中，然后接種于6孔板中進(jìn)行培養(yǎng)。次日分組給藥(分組同油紅O染色)，24 h后，用胰酶消化細(xì)胞并洗滌3次，用結(jié)合緩沖液重新懸浮細(xì)胞，加入5 μL Annexin V/FITC 和10 μL濃度為20 μg/mL的PI溶液，混勻后于室溫避光孵育15 min，后在反應(yīng)管中加400 μL PBS，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。

1.2.6免疫熒光染色 將對數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞按照每孔2.5×104個細(xì)胞接種于24孔板中，接種前與24孔板內(nèi)放置無菌細(xì)胞爬片，每孔加入1 mL完全培養(yǎng)基，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。次日分組給藥(分組同油紅O染色)，24 h后進(jìn)行細(xì)胞固定和封閉，操作步驟如下：將細(xì)胞用PBS洗滌3次，4%多聚甲醛固定30 min，再次用PBS洗滌3次，免疫熒光通透液通透5 min，PBS洗滌3次，用山羊血清封片30 min。然后加入一抗，4 ℃孵育過夜，PBS洗滌3次，加入Alexa Fluor 488標(biāo)記山羊抗兔IgG，PBS洗滌3次，用4′,6-二脒基-2-苯基吲哚染核5 min，PBS洗滌3次，取出細(xì)胞爬片，抗熒光淬滅劑封片，在正置顯微鏡下以495 nm為激發(fā)波長觀察細(xì)胞LC3表達(dá)情況。

2 結(jié) 果

2.1Eze對HepG2細(xì)胞增殖活性的影響 OA組、Eze低濃度組、Eze中濃度組、Eze高濃度組細(xì)胞增殖率分別為(0.829±0.048)%、(0.845±0.105)%、(0.864±0.086)%、(0.796±0.109)%，各組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F=0.202，P=0.892)。

2.2油紅O染色結(jié)果 OA+影響Eze組脂滴含量明顯低于OA組，加入自噬抑制劑CQ后，OA+Eze+CQ組脂滴含量明顯高于OA+Eze組，Eze對OA造模的HepG2細(xì)胞內(nèi)脂滴含量的影響見圖1。

a:CON；b:OA；c:OA+Eze；d:OA+Eze+CQ

2.3Eze對HepG2細(xì)胞Beclin-1和LC3表達(dá)的影響 各組HepG2細(xì)胞Beclin-1和LC3表達(dá)水平比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，其中OA+Eze組Beclin-1/β-actin和LC3Ⅱ/β-actin表達(dá)高于OA組(P<0.05)，OA+Eze+CQ組Beclin-1/β-actin低于OA+Eze組(P<0.05)，OA+Eze+CQ組LC3Ⅱ/β-actin高于OA+Eze組(P<0.05)，見表1。Eze對HepG2細(xì)胞Beclin-1和LC3表達(dá)水平的影響，見圖2。

表1 各組HepG2細(xì)胞Beclin-1和LC3表達(dá)水平的比較

CON：空白對照；OA：油酸；Eze：依澤替米貝；CQ：氯喹；Beclin 1：Beclin-1蛋白；LC3：微管相關(guān)蛋白1輕鏈3；β-actin：β-肌動蛋白；a與OA組比較，P<0.05；b與OA+Eze組比較，P<0.05

CON：空白對照；OA：油酸；Eze：依澤替米貝；CQ：氯喹；Beclin 1：Beclin-1蛋白；LC3：微管相關(guān)蛋白1輕鏈3；β-actin：β肌動蛋白

圖2 Eze對HepG2細(xì)胞Beclin-1和LC3表達(dá)水平的影響

2.4細(xì)胞凋亡實驗檢測結(jié)果 空白對照組、OA組、OA+Eze組、OA+Eze+CQ組細(xì)胞凋亡率分別為(0.820±0.083)%、(2.777±0.114)%、(1.673±0.094)%、(5.710±0.109)%，各組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=109.397,P<0.05)。OA組細(xì)胞凋亡率高于空白對照組(P<0.05)，OA+Eze組細(xì)胞凋亡率低于OA組(P<0.05)；OA+Eze+CQ組細(xì)胞凋亡率高于OA+Eze組(P<0.05)。Eze對OA造模的HepG2細(xì)胞凋亡率的影響，見圖3。

2.5免疫熒光染色結(jié)果 與空白對照組比較，OA組LC3表達(dá)水平無明顯變化，加入Eze后，Eze+OA組LC3表達(dá)水平相較于OA組均升高，加入CQ后，LC3表達(dá)水平相較于Eze+OA組升高，Eze對油酸造模的HepG2細(xì)胞LC3表達(dá)水平的影響見圖4。

3 討 論

近年來NAFLD發(fā)病率不斷增高，卻仍缺乏安全有效的治療藥物，本研究致力于在細(xì)胞水平上探討Eze對NAFLD的治療作用及其機(jī)制。通過OA造模，模擬出NAFLD的細(xì)胞模型，從油紅O染色的結(jié)果可以看出，Eze可顯著降低細(xì)胞模型中脂滴含量，這與Patel等[11]的研究結(jié)果一致，提示Eze可改善NAFLD時肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積。而在加入自噬抑制劑CQ時，其改善脂質(zhì)沉積的效果降低，提示其改善脂質(zhì)沉積的機(jī)制與自噬有一定的相關(guān)性。

CQ作為一種傳統(tǒng)的抗瘧藥，近年來多項研究表明對多種晚期腫瘤具有一定的治療效果[17-20],其抗腫瘤作用正是通過阻礙自噬實現(xiàn)的[21]。CQ含有的疏水性弱堿基，在其擴(kuò)散到溶酶體后被捕獲并質(zhì)子化，導(dǎo)致溶酶體內(nèi)pH值上升，從而阻礙自噬體和溶酶體結(jié)合成自噬溶酶體進(jìn)而降解的過程，在自噬晚期阻礙自噬的發(fā)生、發(fā)展[22]。LC3Ⅱ及Beclin-1作為普遍承認(rèn)的自噬相關(guān)蛋白，LC3Ⅱ/β-actin及Beclin-1水平的增高提示自噬水平升高[23]。CQ對自噬的阻礙作用表現(xiàn)在LC3Ⅱ/β-actin水平的增高及Beclin-1水平的降低。Western blot的結(jié)果提示，相對于OA組，加入Eze后細(xì)胞自噬水平明顯升高，加入Eze和CQ后細(xì)胞自噬水平降低，表明Eze可增強(qiáng)非酒精性脂肪肝細(xì)胞的自噬，而自噬抑制劑CQ表現(xiàn)出對自噬的顯著抑制效果。同時，通過LC3B的免疫熒光染色檢測也與Western blot的結(jié)果一致，提示Eze可增強(qiáng)非酒精性脂肪肝細(xì)胞的自噬，加入CQ后自噬水平下降。

在NAFLD的初始階段，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)過多的脂質(zhì)積聚和脂肪變性，進(jìn)而通過氧化劑或細(xì)胞因子損傷肝細(xì)胞，使疾病進(jìn)展為非酒精性脂肪肝炎[24-25]。促進(jìn)自噬對肝細(xì)胞脂滴沉積減少可能與細(xì)胞自噬體的代謝功能相關(guān)，自噬體含有降解細(xì)胞器相關(guān)脂質(zhì)和外源脂蛋白的脂肪酶，促進(jìn)自噬有助于促進(jìn)自噬體和溶酶體的融合及其脂質(zhì)的分解[24]。Eze在升高細(xì)胞內(nèi)自噬水平的同時降低了細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積水平，且這種作用在加入自噬抑制劑CQ后被抑制，因此，推測Eze可通過增強(qiáng)NAFLD細(xì)胞模型自噬水平減少細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積。

CON：空白對照；OA：油酸；Eze：依澤替米貝；CQ：氯喹；Beclin 1：Beclin-1蛋白；LC3：微管相關(guān)蛋白1輕鏈3；DAPI：4′,6-二脒基-2-苯基吲哚；MERGE：合并

本研究中，加入Eze可明顯改善OA誘導(dǎo)NAFLD細(xì)胞模型的細(xì)胞凋亡率，而加入自噬抑制劑CQ后，其凋亡水平又明顯增加，表明Eze可減輕NAFLD細(xì)胞模型的細(xì)胞凋亡率，自噬抑制劑CQ可在一定程度上逆轉(zhuǎn)這種效果。Schleicher等[26]研究表明細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積減少后，脂肪變性狀態(tài)的細(xì)胞可以被逆轉(zhuǎn)成為健康細(xì)胞。在NAFLD中，細(xì)胞脂質(zhì)沉積是導(dǎo)致細(xì)胞脂性凋亡的最主要原因[27]，本研究中Eze既降低了細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積水平，又減少了細(xì)胞的凋亡率，因此，推測Eze通過增強(qiáng)細(xì)胞自噬水平減少NAFLD細(xì)胞模型中的細(xì)胞凋亡。

綜上所述，Eze在增強(qiáng)細(xì)胞的自噬水平的同時，減輕細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積并明顯減少細(xì)胞凋亡的發(fā)生，且這種效果在CQ顯著抑制自噬后被逆轉(zhuǎn)，因此，說明Eze可能通過增強(qiáng)非酒精性脂肪肝細(xì)胞的自噬水平降低NAFLD細(xì)胞模型脂質(zhì)沉積和凋亡發(fā)生,因此可能對NAFLD具有一定的治療效果。