李聰聰，葉連萌，盧 濤， 吳 姣，徐秋良，宋素芳，李婉濤

(1.河南牧業(yè)經(jīng)濟學(xué)院 動物科技學(xué)院，河南 鄭州 450046； 2.河南省畜禽遺傳資源保護工程技術(shù)研究中心，河南 鄭州 450046)

疾病發(fā)生是我國生豬養(yǎng)殖業(yè)一直存在的問題，且近幾年呈現(xiàn)出日益嚴(yán)重的趨勢。目前，豬的疾病種類很多，并且表現(xiàn)出復(fù)雜化和典型化現(xiàn)象，給生豬養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大危害。其中，病毒性疾病傳播速度快，病豬的死亡率高，防控形勢嚴(yán)峻。病毒能夠寄宿在宿主細胞內(nèi)進行生存和繁殖，不易被消除，并且病毒的遺傳物質(zhì)極易發(fā)生突變，普通疫苗的防控難度大。因此，亟須深入探索與病毒致病相關(guān)的信號通路及其基因的調(diào)控機制，從而找到治療豬病毒病的新思路。

巨噬細胞是動物機體內(nèi)一類重要的免疫細胞，在固有免疫和適應(yīng)性免疫中均發(fā)揮重要作用。當(dāng)豬受到病毒(例如豬藍耳病毒)感染后，首先被影響的便是巨噬細胞(例如肺泡巨噬細胞)。有數(shù)據(jù)表明，感染豬藍耳病毒后，豬體內(nèi)巨噬細胞的功能會受到抑制，形成嚴(yán)重的免疫抑制反應(yīng)，從而導(dǎo)致豬體對其他病毒性和細菌性疾病的易感性明顯增加[1]。

宿主細胞的抗病毒作用主要是Toll受體3(Toll-like receptor 3，TLR3)與病毒雙鏈RNA(Double-stranded RNA，dsRNA)兩者的特異性作用，其作用機制大致有2類：第一，當(dāng)dsRNA與TLR3特異性結(jié)合后，會進入胞內(nèi)并引起干擾素等抗病毒細胞因子的活化，從而抑制病毒的復(fù)制；第二，當(dāng)dsRNA與TLR3特異性結(jié)合后，會激活特異性的RNA酶，從而分解病毒的RNA，以調(diào)控非特異性抗病毒反應(yīng)[2]。朱博等[3]研究表明，TLR3能夠同時介導(dǎo)2種免疫反應(yīng)：TLR3能夠識別dsRNA并發(fā)生天然的抗病毒免疫反應(yīng)；TLR3通過活化髓樣分化因子88(Myeloid differentiation factor 88，MyD88)蛋白，并介導(dǎo)共刺激分子CD86、CD80等其他細胞因子的表達，繼而發(fā)生炎癥反應(yīng)。TLR3可通過MyD88非依賴/TRIF依賴型信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路誘導(dǎo)產(chǎn)生Ⅰ型干擾素(Interferon，IFN)，其中β干擾素TIR結(jié)構(gòu)域銜接蛋白(TIR-domain-containing adapter-inducing interferon β，TRIF)是TLR3介導(dǎo)的MyD88非依賴信號通路中的關(guān)鍵蛋白[4]。當(dāng)TLR3識別dsRNA后，通過TRIF銜接蛋白促進TANK結(jié)合激酶1(TANK-binding kinase 1，TBK1)和IKK激酶ε(Inhibitor-κB kinase ε，IKKε)等轉(zhuǎn)錄因子的生成，從而激活干擾素調(diào)節(jié)因子3(Interferon regulatory factor 3，IRF3)[5-8]，進而誘導(dǎo)共刺激分子CD40、CD80和CD86的表達[9-13]。

本研究使用Poly(I：C)模擬病毒，刺激體外培養(yǎng)的豬肺泡巨噬細胞(3D4/21細胞)，設(shè)計不同的處理時間，觀察3D4/21細胞形態(tài)的變化，采用qPCR方法檢測TLR3基因及其信號通路相關(guān)基因表達量的變化，探討3D4/21細胞在Poly(I：C)刺激下發(fā)生的免疫應(yīng)答分子機制，旨在為豬病毒性疾病的抗病工作提供新的方法和思路。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

Poly(I：C)(tlrl-pic-5)購自InvivoGen公司。將50 mL無菌Poly(I：C)稀釋液PBS(購自Gibco公司)與50 mg的Poly(I：C)粉末加入錐形瓶中,完全稀釋至1 mg/mL，分裝后保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2 3D4/21細胞培養(yǎng)及Poly(I：C)刺激

10%的FBS和89%的1640培養(yǎng)基以及1%的MEM非必需氨基酸溶液(MEM-NEAA)構(gòu)成了培養(yǎng)3D4/21細胞(由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)趙書紅課題組惠贈)的完全培養(yǎng)基，其中FBS、1640培養(yǎng)基和MEM-NEAA均購自Gibco公司。將細胞置于5% CO2、飽和濕度的37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞匯合度達到90%左右時，用25 μg/mL[14]的Poly(I：C)進行刺激，分別在刺激4、8、12、24 h時用倒置顯微鏡觀察3D4/21細胞形態(tài)并于拍照后收集細胞，同時以加入等量稀釋液PBS的3D4/21細胞作為陰性對照，每組設(shè)置3個重復(fù)。

1.3 3D4/21細胞的總RNA提取、反轉(zhuǎn)錄及qPCR

利用Trizol(購自Invitrogen公司)提取細胞的總RNA，并用NanoDrop 1000(購自Invitrogen公司)測定質(zhì)量濃度，并記錄每個樣品的總RNA質(zhì)量濃度和OD260/OD280值。每個樣品取2 μg，加入RNA變性Loading Buffer[15]，進行1.2%瓊脂糖凝膠電泳，檢測28S rRNA、18S rRNA以及5.8S rRNA條帶的完整性。

用DNaseⅠ(購自Invitrogen公司)對提取的總RNA去除基因組DNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒K1622(購自Invitrogen公司)的操作步驟進行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄結(jié)束后，將cDNA置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

以所得cDNA為模板，對TLR3、IRF3、CD86、IFNα基因的表達量進行檢測分析，各基因檢測引物見表1，引物由上海生工生物工程有限公司進行合成。10 μL的反應(yīng)體系：5 μL 2×SYBR?Green Real-time PCR Master Mix(購自Toyobo公司)，25 pmol引物，50 ng模板cDNA，補水至10 μL。利用ABI7500 Fast系統(tǒng)進行實時熒光定量PCR檢測。擴增程序：95 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40個循環(huán)；95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，95 ℃ 30 s，60 ℃ 15 s。

表1 定量PCR引物信息Tab.1 The information of primers for qPCR

1.4 數(shù)據(jù)處理

qPCR數(shù)據(jù)用相對定量2-ΔΔCt法進行分析[18]，GAPDH作為內(nèi)參基因?qū)Ω骰虮磉_水平進行校正。t檢驗分析數(shù)據(jù)差異顯著性，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 Poly(I：C)刺激下不同處理時間3D4/21細胞形態(tài)變化

如圖1所示，對照組的3D4/21細胞均呈現(xiàn)橢圓形和不規(guī)則形狀，胞內(nèi)漿液較為豐富，且細胞呈現(xiàn)均勻密集分布，貼壁良好。但在Poly(I：C)刺激下，4 h時試驗組的3D4/21細胞大部分為貼壁細胞，大多數(shù)仍呈橢圓形，只有少量的圓形死細胞出現(xiàn)；8 h時試驗組的3D4/21細胞密度增大，圓形死細胞的數(shù)量開始增多；12 h時試驗組的3D4/21細胞發(fā)生形態(tài)變化，出現(xiàn)較多菱形、星形的細胞，還有少部分細胞出現(xiàn)偽足和突起；24 h時試驗組的大部分3D4/21細胞出現(xiàn)清晰的偽足和突起，且出現(xiàn)大量的圓形死細胞，并且隨著處理時間的延長，試驗組死細胞越來越多。

圖1 Poly(I：C)刺激下不同處理時間3D4/21細胞的形態(tài)(×100)Fig.1 The morphological changes of the 3D4/21 cells after stimulation with Poly(I：C) (×100)

2.2 3D4/21細胞總RNA的提取及質(zhì)量檢測

瓊脂糖凝膠電泳檢測提取的3D4/21細胞總RNA，共顯示出3條亮帶(28S rRNA、18S rRNA和5.8S rRNA)，其中28S rRNA條帶亮度接近18S rRNA條帶亮度的2倍，并且點樣孔附近沒有其他條帶的出現(xiàn)(圖2)，說明所獲得的細胞總RNA完整性及質(zhì)量良好。

圖2 3D4/21細胞總RNA瓊脂糖凝膠電泳(部分)Fig.2 Total RNA agarose gel electrophoresis of 3D4/21 cells (Section)

2.3 Poly(I：C)刺激下3D4/21細胞中TLR3基因及其信號通路相關(guān)基因表達量變化

在Poly(I：C)刺激下，4個處理時間中試驗組TLR3基因和IRF3基因的表達量均呈現(xiàn)先下調(diào)后上調(diào)趨勢。與對照組相比，在4 h和8 h時，試驗組TLR3基因表達量與對照組無顯著差異；在12 h時，試驗組TLR3基因的表達量是對照組的1.63倍，且差異顯著(P<0.05)；在24 h時，試驗組TLR3基因的表達量最高，是對照組的2.77倍，且差異顯著(P<0.05)(圖3)；在4個處理時間中，試驗組IRF3基因的表達量均高于對照組，但差異均不顯著(圖3)。在Poly(I：C)刺激下，4個處理時間中試驗組IFNα基因的表達量呈上調(diào)趨勢。與對照組相比，4 h時試驗組IFNα基因的表達量略有上升，但差異不顯著；在8 h和12 h時，試驗組IFNα基因的表達量分別是對照組的1.84倍和2.14倍，且差異顯著(P<0.05)；在24 h時，試驗組IFNα基因的表達量最高，是對照組的2.91倍，且差異顯著(P<0.05)(圖3)。在Poly(I：C)刺激下，4個處理時間中試驗組CD86基因的表達量呈先上調(diào)后下調(diào)的趨勢，在4、8、12 h時，試驗組CD86基因表達量均較對照組大幅度上升。在4 h時，CD86基因的表達量是對照組的4.70倍，差異顯著(P<0.05)；在8 h時，CD86基因的表達量是對照組的7.92倍，差異極顯著(P<0.01)；在12 h時，CD86基因的表達量最高，是對照組的17.60倍，差異極顯著(P<0.01)；但在24 h時，試驗組CD86基因的表達量較8 h和12 h呈現(xiàn)下調(diào)趨勢，并且其表達量是對照組的6.00倍，差異極顯著(P<0.01)(圖3)。以上數(shù)據(jù)表明，當(dāng)Poly(I：C)刺激3D4/21細胞時，能夠誘導(dǎo)TLR3基因及其信號通路相關(guān)基因的表達量發(fā)生變化，其中TLR3和IRF3基因表達趨勢均呈現(xiàn)波動上調(diào)，IFNα基因呈現(xiàn)持續(xù)上調(diào)的趨勢，而CD86基因的表達則表現(xiàn)為先上調(diào)后下調(diào)的趨勢。

*表示差異顯著(P<0.05)；**表示差異極顯著(P<0.01)

3 結(jié)論與討論

3.1 Poly(I：C)刺激下3D4/21細胞形態(tài)的變化

一般情況下，3D4/21細胞呈現(xiàn)橢圓形或不規(guī)則形態(tài)，在dsRNA刺激下，3D4/21細胞會隨著處理時間的延長發(fā)生懸浮，最終變?yōu)樗兰毎藭r3D4/21細胞形態(tài)主要呈現(xiàn)圓形，被Poly(I：C)刺激后的3D4/21細胞形態(tài)會隨著處理時間的推移，發(fā)生相應(yīng)的變化[18]。最初，細胞主要呈現(xiàn)橢圓形或不規(guī)則形狀，且胞漿豐富[19]；用Poly(I：C)刺激4 h后，3D4/21細胞的貼壁性良好，但隨著處理時間的延長，細胞密度會逐漸增大并出現(xiàn)鈍形偽足和突起。楊志梅等[20]報道，在一定劑量的病毒刺激下，隨著時間的推移3D4/21細胞會變圓死亡，且在24 h時死亡數(shù)量最多，與本研究結(jié)果一致。

3.2 Poly(I：C)刺激下TLR3基因及其信號通路相關(guān)基因表達量的變化

本研究中，試驗組受體基因TLR3和IRF3基因均呈現(xiàn)波動上調(diào)趨勢，均在24 h達到最高表達量，在24 h時，試驗組TLR3和IRF3基因的表達量分別是對照組的2.77倍和1.42倍；細胞因子IFNα基因的表達量于4個處理時間呈上調(diào)趨勢，在24 h時，試驗組IFNα基因的表達量是對照組的2.91倍；共刺激分子CD86的表達量于4個處理時間呈先上調(diào)后下調(diào)的趨勢，在12 h時，試驗組CD86基因的表達量是對照組的17.60倍。

王繼英等[17]設(shè)置4種Poly(I：C)質(zhì)量濃度(0、10、20、40 μg/mL)和4個處理時間(4、8、12、24 h)對豬的外周血單核細胞進行刺激，檢測TLR3、IRF3、IFNα基因的表達水平變化發(fā)現(xiàn)，在Poly(I:C)質(zhì)量濃度為20～40 μg/mL時，TLR3和IRF3基因的表達量隨處理時間的延長逐漸增加，并在刺激24 h時的表達量最高，與本研究測定結(jié)果一致；在Poly(I：C)刺激4 h時IFNα基因的表達量最高，但隨著處理時間的延長其表達量逐漸降低，本研究中，IFNα基因的表達量在刺激24 h時達到最高，推測原因可能是單核細胞與3D4/21細胞類型的差異造成，并且供試Poly(I：C)可能也存在一定的差異。王彥平等[16]用20 μg/mL的Poly(I：C)刺激長白豬的外周血單核細胞24 h，檢測免疫應(yīng)答過程中相關(guān)基因的表達變化，結(jié)果表明，TLR3和IFNα基因表達量均上調(diào)，但變化不大，刺激組的IRF3基因表達量較對照組下調(diào)，而本研究中，IRF3基因的表達量波動上調(diào)，但差異不顯著(P>0.05)，推測可能的原因是細胞類型不同，且細胞來源存在個體差異。王海飛[21]用20 μg/mL的Poly(I：C)刺激長白豬的外周血單核細胞，分別選擇0、4、8、12、24 h為處理時間，檢測免疫應(yīng)答過程中相關(guān)基因的表達水平變化，結(jié)果表明，在Poly(I：C)刺激24 h時，TLR3和IRF3基因的表達量達到最高，與本研究結(jié)果一致；在Poly(I∶C)刺激4 h時，IFNα基因的表達量最高，隨后逐漸降低，而在本研究中，IFNα基因的表達量在Poly(I：C)刺激24 h時最高，與對照組相比差異顯著(P<0.05)。王冬梅等[22]用100 μg/L的Poly(I：C)與200個TCID50的豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)感染的豬肺泡巨噬細胞(PAM細胞)，分別在12、24、36、48 h時檢測IRF3基因的表達量發(fā)現(xiàn)，12 h時IRF3基因的表達量最高，但在本研究中，IRF3基因的表達量在12 h和24 h持續(xù)上調(diào)，推測原因可能是PRRSV存在一定的作用。WANG等[23]用1 μg/mL的Poly(I：C)刺激雞胚成纖維細胞(CEFs)，并分別于2、6、12、20 h時檢測IRF3基因的表達水平發(fā)現(xiàn)，在Poly(I：C)刺激6 h時，IRF3基因表達量最高，隨后IRF3基因的表達量下降。王冬梅等[24]用PRRSV感染PAM細胞1 h，而后用100 μg/mL的Poly(I：C)刺激細胞，繼續(xù)培養(yǎng)12、24、36、48 h，收集細胞檢測PAM細胞中的IFNα基因表達水平變化發(fā)現(xiàn)，刺激組與對照組相比，IFNα基因的表達量顯著上調(diào)，證明PRRSV和Poly(I：C)刺激PAM細胞后均能促進IFNα基因的轉(zhuǎn)錄，與本研究結(jié)果一致。LI等[14]用25 μg/mL的Poly(I：C)刺激豬PK15細胞，并分別在0、4、12、24 h時進行檢測發(fā)現(xiàn)，于Poly(I：C)刺激12 h前，CD86基因表達量基本無變化，但在24 h時表達量最高，而本研究中，在Poly(I：C)刺激12 h時，試驗組CD86基因的表達量最高，但在24 h時其表達量較12 h時降低，與對照組相比差異均極顯著(P<0.01)，推測原因可能是供試細胞的類型不同。綜上所述，不同類型或不同來源的細胞對不同批次Poly(I：C)的耐受力不同，Poly(I：C)刺激的質(zhì)量濃度和處理時間選擇不同，另外還有個體差異的因素都會對結(jié)果產(chǎn)生影響。

本研究采用Poly(I：C)體外刺激3D4/21細胞，qPCR檢測TLR3基因及其信號通路相關(guān)基因的表達量變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Poly(I：C)能夠誘導(dǎo)TLR3、IRF3、IFNα和CD86基因的上調(diào)表達，表明豬體感染病毒時TLR3信號通路發(fā)揮了重要調(diào)控作用，為豬病毒病的抗病育種防治提供新的方法和策略。