肖澤凡，朱崇文，戴林建，宋 浩，鐘 軍

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院 煙草系，湖南 長沙 410128； 2.湖南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司，湖南 長沙 410014)

鉀是植物重要的礦質(zhì)元素，參與眾多生理活動，如酶的活化、氣孔開閉、膜電勢的維持以及滲透調(diào)節(jié)等[1]。鉀離子參與多種酶的活化，在植物生長發(fā)育及蛋白質(zhì)合成中發(fā)揮重要功能[2]。煙草是典型的喜鉀作物，鉀也是煙草吸收最多的一種礦質(zhì)元素，對提高煙葉燃燒性、改善煙葉品質(zhì)、減少焦油產(chǎn)生均有重要作用[3]。因此，研究不同鉀濃度環(huán)境下煙葉蛋白質(zhì)的差異對煙草栽培調(diào)控意義較大。

蛋白質(zhì)組學(xué)是研究細胞、組織或生物體全套蛋白質(zhì)組成及其變化規(guī)律的學(xué)科，具體包括蛋白質(zhì)的表達水平、翻譯后修飾的種類等，從整體水平上研究蛋白質(zhì)的組成和調(diào)控規(guī)律[4]。張柳等[5]研究了煙草葉片衰老過程的蛋白質(zhì)差異，認為與光合作用等合成代謝相關(guān)的蛋白質(zhì)多下調(diào)表達，與逆境反應(yīng)和呼吸作用等分解代謝相關(guān)的蛋白質(zhì)多上調(diào)表達。徐瑩等[6]研究3個主栽煙草品種的差異蛋白質(zhì)，鑒定出的蛋白質(zhì)大部分參與光合作用、物質(zhì)代謝或與抗逆性相關(guān)。可見，蛋白質(zhì)組學(xué)分析能夠揭示煙葉蛋白質(zhì)的變化和相關(guān)功能，為豐富煙草基礎(chǔ)科學(xué)研究提供基礎(chǔ)。蛋白質(zhì)非標(biāo)記定量(Label-free)技術(shù)是蛋白質(zhì)組學(xué)研究中常見的方法，它是一種不對蛋白質(zhì)進行任何標(biāo)記的定量方式，可對不同來源的同一樣本的定量數(shù)據(jù)進行比較，數(shù)據(jù)移植性高，且對質(zhì)譜儀的分辨率、靈敏度和穩(wěn)定性等有著很高的要求[4]。黃宇等[7]基于Label-free方法對小麥抗病基因系和背景品種葉片蛋白質(zhì)進行比較分析，發(fā)現(xiàn)大部分差異蛋白質(zhì)具備結(jié)合和催化等功能，參與代謝、細胞過程和應(yīng)激反應(yīng)等生物進程，為進一步研究小麥條銹病抗性奠定了基礎(chǔ)。

目前，蛋白質(zhì)組學(xué)在各個領(lǐng)域都有著廣泛的應(yīng)用，煙草中也有不少相關(guān)研究，但在不同鉀濃度環(huán)境下應(yīng)用Label-free方法探索煙草差異蛋白質(zhì)的研究較少。鑒于此，在高鉀和正常鉀水平下對烤煙品系進行水培培育，并利用Label-free技術(shù)鑒定高鉀與正常鉀濃度下苗期葉片差異蛋白質(zhì)的表達情況，探究不同鉀濃度下葉片差異蛋白質(zhì)的定位、功能以及參與的通路途徑，為進一步了解高鉀環(huán)境中煙葉蛋白質(zhì)的變化以及烤煙栽培育種調(diào)控提供基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 供試材料、試劑與儀器

供試烤煙材料為戴林建等[8]自育的烤煙高鉀品系HKDN-5，該品系農(nóng)藝性狀穩(wěn)定，株高、節(jié)距、莖圍等農(nóng)藝性狀和葉片中總氮、蛋白質(zhì)、煙堿、鉀等化學(xué)成分含量較普通烤煙優(yōu)勢明顯[9]。

主要試劑有Tris飽和酚、牛血清蛋白、Trypsin，均購自Promega生物技術(shù)有限公司，其他試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。

主要儀器：Q-Exactive質(zhì)譜儀，購自美國Thermo Fisher Scientific公司；Nano ACQUITY超高效液相色譜儀，購自美國Waters Corporation公司。

1.2 試驗設(shè)計

取供試煙草種子播種于育苗盤中，采用漂浮方式培養(yǎng)。試驗材料分為2組，第1組為高鉀營養(yǎng)液(K+質(zhì)量濃度為720 mg/L)處理，在Hoagland’s營養(yǎng)液中增加硝酸鉀含量來實現(xiàn)高鉀處理，同時以減少配方中硝酸銨的含量來保證氮適量；第2組為正常營養(yǎng)液(K+質(zhì)量濃度為240 mg/L)處理(對照)。2組處理保持溫度、營養(yǎng)、光照等各種其他因素一致。

1.3 樣品采集、蛋白質(zhì)制備及濃度測定

待煙苗生長到5～6片葉，2組均選取長勢正常的4～5株植株，取其葉片制成混合樣，每組取3個重復(fù)樣，用鋁箔紙包好，編號，裝入布袋，迅速投入液氮罐中保存?zhèn)溆?。采用苯酚法[10]提取煙葉蛋白質(zhì)，同時采用Bradford法[11]測定蛋白質(zhì)濃度。

1.4 蛋白酶解與nano-HPLC-MS/MS分析

取100 μg葉片樣品至新試管中，加入8 mol/L尿素定容至100 μL。之后向試管中加入11 μL 1 mol/L DTT，于37 ℃下放置1 h，隨后將試管中的混合液體移至10 K超濾管中，14 000×g離心10 min，加入120 μL 55 mmol/L碘乙酰胺，在室溫下避光溫育20 min。取超濾管連續(xù)離心3次，每次離心在超濾管中加入100 mmol/L TEAB，離心后置換尿素體系，加入胰蛋白酶(Trypsin)，蛋白質(zhì)與酶的質(zhì)量比為50∶1，酶解過夜后凍干。

將凍干的肽段重溶于30 μL 0.1%甲酸水溶液中，用nano-HPLC分離，進行在線電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜分析。試驗在Nano ACQUITY UPLC系統(tǒng)上進行，分離的肽段進入到Q-Exactive質(zhì)譜儀。Q-Exactive質(zhì)譜儀在數(shù)據(jù)依賴采集模式下運行，自動在MS和MS/MS采集間切換。在70 K質(zhì)量分辨率下獲得全掃描譜圖，隨后在17.5 K分辨率下進行后續(xù)HCD MS/MS掃描。將10 μL肽段樣品以10 μL/min流量上樣到捕集柱(Thermo Scientific Acclaim PepMap C18,100 μm×2 cm)，隨后在分析柱(Acclaim PepMap C18,75 μm×15 cm)中以線性梯度分離：120 min內(nèi)0.1%甲酸ACN溶液從3%均勻增加至32%。柱子在初始條件下平衡10 min，柱流量控制在300 nL/min，電噴霧電壓2 kV。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用PEAKS Studio version 8.5(Bioinformatics Solutions Inc.,Waterloo,Canada)對串聯(lián)質(zhì)譜圖進行分析。利用PEAKS DB對UniProt-Nicotiana數(shù)據(jù)庫(ver.201711,73606 entries)進行搜索，設(shè)置trypsin酶解。搜庫參數(shù)為，碎片離子質(zhì)量容許誤差0.05 u，母離子質(zhì)量容許誤差0.001%，最大漏切數(shù)2，固定修飾Carbamidomethylation 57.02，可變修飾Oxidation (M) 15.99、Deamidation (NQ) 0.98、Acetylation (Protein N-term) 42.01。肽段經(jīng)過1% FDR和1 Unique peptide質(zhì)控過濾。篩選差異倍數(shù)1.5倍以上、含有至少2條unique肽段、ANOVA算法中Significance大于13(即P<0.05)的蛋白質(zhì)作為差異蛋白質(zhì)。并對其進行GO(Gene ontology)分析，包括蛋白質(zhì)的分子功能、細胞中所處的位置以及參與的生物過程，通過COG & KOG注釋分析進行蛋白質(zhì)功能預(yù)測、分類，通過KEGG pathway分析富集到該通路(P<0.05)的蛋白質(zhì)參與的生物過程。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同鉀濃度下煙草葉片蛋白質(zhì)SDS-PAGE電泳結(jié)果

由圖1可見，高鉀和正常鉀濃度下煙草葉片蛋白質(zhì)分布均勻，均無極高豐度的蛋白質(zhì)，符合色譜質(zhì)譜檢測對蛋白質(zhì)豐度的要求，兩者也具有相似的蛋白質(zhì)條帶。

圖1 不同鉀濃度下煙草葉片蛋白質(zhì)SDS-PAGE電泳結(jié)果Fig.1 SDS-PAGE electrophorogram of tobacco leaf proteins at differential potassium concentrations

2.2 不同鉀濃度下煙草葉片差異蛋白質(zhì)的鑒定及統(tǒng)計分析

對差異倍數(shù)1.5以上，差異顯著度P<0.05的葉片差異表達蛋白質(zhì)數(shù)量進行統(tǒng)計，結(jié)果見表1。由表1可知，與正常鉀濃度處理相比，高鉀濃度下差異表達蛋白質(zhì)總數(shù)為41個，其中下調(diào)的蛋白質(zhì)有20個，上調(diào)的蛋白質(zhì)有21個。大部分上調(diào)蛋白質(zhì)的差異倍數(shù)高于下調(diào)蛋白質(zhì)，且集中在[2,4)差異倍數(shù)區(qū)間，占上調(diào)差異蛋白質(zhì)總數(shù)的57.1%。下調(diào)差異蛋白質(zhì)主要集中在[1.5,2)差異倍數(shù)區(qū)間，占下調(diào)差異蛋白質(zhì)總數(shù)的75.0%。差異蛋白質(zhì)總數(shù)主要集中在[1.5,4)差異倍數(shù)區(qū)間，合計38個，占差異蛋白質(zhì)總數(shù)的92.7%。

表1 不同差異倍數(shù)的煙草葉片差異蛋白質(zhì)數(shù)量 個

注：a表示差異倍數(shù)。

Note：The letter a means difference multiplier.

2.3 不同鉀濃度下煙草葉片差異蛋白質(zhì)的生物信息學(xué)分析

2.3.1 差異蛋白質(zhì)的GO注釋 Gene ontology(GO) 是一個國際標(biāo)準(zhǔn)化的基因本體功能分類體系工具，用來全面描述生物體中基因和蛋白質(zhì)的屬性。GO共分為三大類，分別為細胞組成、基因或蛋白質(zhì)的分子功能、參與的生物過程。由表2可見，高鉀處理與正常鉀處理的煙草葉片差異蛋白質(zhì)全部定位在細胞組分和有膜細胞器中；77%的差異蛋白質(zhì)具有水解酶活性的分子功能，其他參與碳水化合物結(jié)合；70%的差異蛋白質(zhì)參與細胞代謝、單體代謝和單體細胞過程。

2.3.2 差異蛋白質(zhì)的KOG注釋 如圖2所示，高鉀處理與正常鉀處理的差異蛋白質(zhì)具有的功能不同，可分為12種，分別為能量產(chǎn)生和轉(zhuǎn)換，氨基酸運輸和代謝，碳水化合物運輸和代謝，脂質(zhì)運輸和代謝，翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)和生物起源，復(fù)制、重組和修復(fù)，翻譯后修飾、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)換、伴侶蛋白，無機離子運輸和代謝，次生代謝產(chǎn)物生物合成運輸和分解代謝，一般功能，未知功能，細胞骨架等相關(guān)蛋白質(zhì)，分別表示為C、E、G、I、J、L、O、P、Q、R、S、Z功能蛋白質(zhì)。其中，數(shù)量最多的為E、G類蛋白質(zhì)，且G類蛋白質(zhì)上調(diào)數(shù)量最多，E、S類蛋白質(zhì)下調(diào)數(shù)量最多；I、O、Z類功能只有上調(diào)蛋白質(zhì)，J、L、Q、R、S類功能只有下調(diào)蛋白質(zhì)。說明高鉀濃度主要影響煙葉蛋白質(zhì)關(guān)于碳水化合物運輸和代謝(G類)以及氨基酸運輸和代謝(E類)方面的功能，且碳水化合物運輸、代謝相關(guān)功能類蛋白質(zhì)在高鉀濃度下會出現(xiàn)上調(diào)表達，這在促進煙葉生長發(fā)育方面發(fā)揮著重要作用。

表2 不同鉀濃度下煙草葉片差異蛋白質(zhì)的GO注釋結(jié)果Tab.2 GO annotation of differential proteins of tobacco leaf at differential potassium concentrations

C：能量產(chǎn)生和轉(zhuǎn)換；E：氨基酸運輸和代謝；G：碳水化合物運輸和代謝；I：脂質(zhì)運輸和代謝；J：翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)和生物起源；L：復(fù)制、重組和修復(fù)；O：翻譯后修飾、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)換、伴侶蛋白；P：無機離子運輸和代謝；Q：次生代謝產(chǎn)物生物合成運輸和分解代謝；R：一般功能，S：未知功能；Z：細胞骨架等相關(guān)蛋白質(zhì)

在高鉀與正常鉀處理的煙葉差異表達蛋白質(zhì)中，有28個具有KOG號。對這些具有KOG號且差異倍數(shù)≥2的差異蛋白質(zhì)進行列表(表3)，能較為直觀地了解到差異倍數(shù)較大的差異蛋白質(zhì)的具體名稱、上下調(diào)變化情況及其具有的KOG功能等，進一步了解其在煙葉生長發(fā)育過程中可能發(fā)揮的作用。由表3可知，在差異倍數(shù)≥2的差異蛋白質(zhì)中，有10個(7個上調(diào)，3個下調(diào))參與到C、E、G、I、P和Q等代謝過程；3個(均上調(diào))參與到O和Z等細胞過程和環(huán)境信息處理過程；1個(下調(diào))參與到S過程。

2.3.3 差異蛋白質(zhì)的KEGG pathway分析 KEGG是一個整合了基因組、化學(xué)和系統(tǒng)功能信息的，用于查詢代謝通路、酶促通路的基因以及生物化學(xué)物質(zhì)的在線數(shù)據(jù)庫，可確定蛋白質(zhì)參與的最主要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和生化代謝通路，基于pathway的分析更有助于了解基因或蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能[12]。根據(jù)差異蛋白質(zhì)的KEGG pathway分析得出，高鉀與正常鉀處理的煙葉差異蛋白質(zhì)共參與96條通路途徑。包含42個代謝通路、21個合成途徑通路和其他降解通路等。其中，包括脂肪酸降解途徑，丙氨酸、天門冬氨酸和谷氨酸代謝途徑，α-亞麻酸代謝途徑，苯丙素合成途徑等通路。這些途徑基本均與物質(zhì)代謝途徑相關(guān)，可見，在高鉀環(huán)境中，苗期煙葉差異蛋白質(zhì)主要與物質(zhì)代謝相關(guān)，為煙葉更好地生長發(fā)育提供基礎(chǔ)。

表3 不同鉀濃度下煙草葉片差異蛋白質(zhì)鑒定

注：倍性變化為正數(shù)，表示差異蛋白質(zhì)上調(diào)表達，反之，為下調(diào)表達。

Note:Fold change is a positive number,which indicates the upward expression of differential protein,conversely,it is down expression.

3 結(jié)論與討論

3.1 與代謝相關(guān)的煙草葉片差異蛋白質(zhì)

本試驗結(jié)果表明，與正常鉀處理相比，高鉀處理下煙草苗期葉片參與代謝相關(guān)的差異蛋白質(zhì)有β-半乳糖苷酶、銅轉(zhuǎn)運蛋白、肌醇-3-磷酸合成酶、絲氨酸羧肽酶、乙醇脫氫酶和谷氨酸脫氫酶等，且大部分都表現(xiàn)為上調(diào)表達。

β-半乳糖苷酶又名乳糖酶，廣泛存在于動物、植物以及微生物中，能夠水解乳糖，且具有半乳糖苷轉(zhuǎn)移功能[13]，該酶具有較強的轉(zhuǎn)糖基活性，能夠高效轉(zhuǎn)化乳糖生產(chǎn)低聚半乳糖[14]。研究發(fā)現(xiàn)，該酶具有2個功能團，分別是可作為親和試劑攻擊糖基第一個碳原子上的親和中心的咪唑基和可使半乳糖苷殘基上的氧原子質(zhì)子化的硫氫基。β-半乳糖苷酶水解乳糖的產(chǎn)物為煙葉的生長提供物質(zhì)基礎(chǔ)。銅轉(zhuǎn)運蛋白[15]是一種定位于細胞膜的跨膜轉(zhuǎn)運蛋白，除了轉(zhuǎn)運銅離子外，也可以轉(zhuǎn)運其他金屬離子。轉(zhuǎn)運體相關(guān)的蛋白質(zhì)發(fā)生適量上調(diào)表達，更有利于機體在高鉀環(huán)境中的生長發(fā)育。在高鉀營養(yǎng)下，代謝途徑增強，使糖基類物質(zhì)累積，而其水解酶活性的加強便是維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的應(yīng)對之策。 肌醇-3-磷酸合成酶是一個高度保守的酶，是植酸合成中催化形成肌醇環(huán)的重要酶，該酶主要將葡萄糖6-磷酸轉(zhuǎn)化成肌醇-磷酸[16]。研究表明，由肌醇誘導(dǎo)合成的肌醇-3-磷酸可以在葉綠體中起滲透壓的作用[17]。絲氨酸羧肽酶是一類屬于α/β水解酶家族的蛋白酶，在許多生化途徑中起作用，該酶基因是植物的一種抗逆基因，在植物生長發(fā)育及抵抗逆境方面發(fā)揮重要作用[18]。乙醇脫氫酶是乙醇發(fā)酵的主導(dǎo)酶，能夠催化乙醛和乙醇間的氧化還原反應(yīng)，在植物無氧呼吸過程中發(fā)揮功能[19]，是植物非正常呼吸鏈的重要水解酶，很多研究表明，該酶與植物抗逆生理也密切相關(guān)[20]。谷氨酸脫氫酶是生物界廣泛存在的多聚酶之一，能夠催化谷氨酸合成，維持植物體內(nèi)氮循環(huán)穩(wěn)定，對植物體的抗逆境能力起著重要作用[21]。但在高鉀濃度下，植株的鉀營養(yǎng)豐富且其他條件也較為適宜，致使抗逆類酶發(fā)生下調(diào)表達。

3.2 與細胞過程和環(huán)境信息處理相關(guān)的煙草葉片差異蛋白質(zhì)

煙草苗期葉片中β-微管蛋白和14-3-3蛋白在高鉀濃度下發(fā)生上調(diào)表達。β-微管蛋白對植物體生長進程起著關(guān)鍵性作用，具體表現(xiàn)為參與細胞骨架形成過程，且在高鉀環(huán)境中作用更明顯。微管是真核生物細胞骨架的重要組成部分，微管骨架在細胞分裂、細胞極性生長和細胞分化等過程中起著極其重要的作用[22]。β-微管蛋白普遍存在于真核細胞中，不僅在維持細胞形態(tài)、保持細胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)的有序性中起重要作用，而且與細胞器的組成與運輸、信號物質(zhì)的傳導(dǎo)、細胞的分化發(fā)育以及細胞分裂增殖等方面發(fā)揮重要作用，是細胞不可缺少的重要組成[23]。14-3-3蛋白是一類廣泛存在于真核生物且高度保守的可溶性酸性蛋白質(zhì)，參與調(diào)控信號傳遞、細胞循環(huán)、代謝、跨膜運輸以及逆境響應(yīng)等多種細胞過程[24]；而且該蛋白質(zhì)還能改變酶活性、調(diào)節(jié)植物生長、影響離子通道活性、介導(dǎo)植物激素信號、光信號以及影響生物和非生物逆境脅迫等[25]。高鉀營養(yǎng)條件下，各類代謝途徑或運輸途徑均強化，故該蛋白質(zhì)表達也發(fā)生上調(diào)。

3.3 煙草葉片其他差異蛋白質(zhì)的表達

病機相關(guān)蛋白是高鉀處理與正常鉀處理煙草葉片中差異倍數(shù)在2倍以上的蛋白質(zhì)，且發(fā)生下調(diào)表達，可能是因為在高鉀環(huán)境中并不需要此類蛋白質(zhì)發(fā)揮作用。

此外，高鉀濃度下的差異蛋白質(zhì)在遺傳信息處理相關(guān)過程中差異并不明顯，可能是在本試驗所設(shè)定鉀濃度下該方面的蛋白質(zhì)作用變化并不顯著。鉀在植物體內(nèi)有2種跨膜轉(zhuǎn)運機制，分別是鉀離子通道和鉀離子轉(zhuǎn)運體[26]。而在本試驗鑒定的蛋白質(zhì)中，并未發(fā)現(xiàn)與已報道的鉀轉(zhuǎn)運體[27]或離子通道直接相關(guān)的蛋白質(zhì)，推測可能的原因有煙葉苗期此類蛋白質(zhì)的差異并不明顯、此類蛋白質(zhì)主要作用在根系中，也可能與高鉀濃度或烤煙高鉀品系的特殊性相關(guān)。具體的原因有待進一步研究。

綜上，高鉀環(huán)境中烤煙苗期葉片差異蛋白質(zhì)主要定位在細胞組分和有膜細胞器中，具有水解酶活性、碳水化合物結(jié)合等分子功能，參與細胞代謝過程、單體代謝過程和單體細胞過程等生物過程。大部分差異蛋白質(zhì)為碳水化合物運輸和代謝相關(guān)功能的蛋白質(zhì)，且主要參與物質(zhì)代謝等相關(guān)途徑，這些差異蛋白質(zhì)在高鉀環(huán)境中對促進煙葉生長發(fā)育發(fā)揮著關(guān)鍵作用。