李 亞，王珠娜

(1.廣東海洋大學 農(nóng)學院，廣東 湛江 524088； 2.鄭州市林業(yè)局，河南 鄭州 450015)

黃龍病(HLB)是柑橘生產(chǎn)上最嚴重的病害之一。病原菌屬韌皮部桿菌屬革蘭氏陰性細菌，目前發(fā)現(xiàn)引起柑橘黃龍病的病原主要有3種，分別是CandidatusLiberibacter asiaticus(CLas)、Ca.L.africanus和Ca.L.americanus[1]。其中，CLas是危害我國柑橘各品種的唯一病原菌，由于該病原菌不能人工培養(yǎng)，關于病原生物學的理論研究缺乏，導致CLas與寄主植物之間的互作研究進展緩慢。長春花(Catharanthusroseus)是一種熱帶多年生植物，屬于夾竹桃科，主要用作觀賞植物。該植物能夠合成多種單萜吲哚生物堿，其中長春堿和長春新堿可用作臨床治療的抗癌藥物。此外，研究證實，長春花可以通過病芽嫁接或以菟絲子為媒介的方式感染黃龍病菌，而且長春花染病后葉片上的癥狀更明顯，病菌濃度更高，因此常用作研究黃龍病的指示植物和試驗材料[2-3]。

植物中，法尼基轉移酶(FTase)首先在擬南芥(Arabidopsisthaliana)脫落酸(ABA)超敏型植株中被發(fā)現(xiàn)，其參與ABA信號傳導途徑[4]。在擬南芥中，編碼法尼基轉移酶β-亞基基因FTB的缺失或FTB的特異性抑制均可促使ABA誘導的S型防御細胞陰離子通道被激活，細胞內(nèi)Ca2+濃度迅速增加；同時葉片中ABA濃度升高，最終使葉片氣孔關閉[5]。研究表明，在擬南芥和亞麻(Linumusitatissimum)中，F(xiàn)TB也能在植物遭受病原感染和干旱時其表達量顯著上升，從而誘導植物體內(nèi)抗性基因的表達以抵抗不良的影響因子，但其具體機制暫不明確[6-7]。在本研究中，以研究黃龍病菌的指示植物長春花為材料，采用RACE技術獲取長春花法尼基轉移酶β-亞基基因crFTB，并通過實時定量PCR技術研究crFTB在CLas感染長春花過程中的表達模式，以期為解析長春花與黃龍病菌互作的分子機制提供參考。

1 材料和方法

1.1 植物材料

將長春花種子播撒于50孔育苗盆內(nèi)，待幼苗長至3 cm左右時移栽至直徑15 cm花盆內(nèi)，待100株長春花幼苗長至20 cm時作為試驗材料。將長春花幼苗隨機分為試驗組和對照組，每組50株，分別用已感染CLas的長春花枝條(病芽條)和健康的長春花枝條(健康芽條)作為材料，以去頂嫁接的方式對試驗組和對照組的長春花幼苗進行嫁接[8]。將嫁接后的長春花苗放于陰涼處，避免陽光直射，并保持嫁接口處濕潤，7 d后轉移至正常環(huán)境中，隔天澆水一次。

1.2 取樣方法

在病芽嫁接后0、4、8、12、16、20、24、28、32、36、40 d(DAI：days after inoculation)，將試驗組中每株長春花葉片作為獨立的樣品，掛好標簽后直接在液氮中保存，作為RNA提取的備用材料。同時在32 DAI取所有長春花位于嫁接點下方的葉片提取DNA，依照JAGOUEIX等[9]方法對CLas進行PCR檢測，以檢測CLas陽性的植株作為已感染的長春花植株。取上述液氮中保存的CLas陽性植株的葉片，作為RNA提取的材料。

1.3 試驗方法

1.3.1 長春花葉片總RNA提取及反轉錄 應用Omega Plant RNA Kit(Omega，USA)提取CLas陽性植株葉片樣品中的總RNA，其完整性和濃度經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定和Nanodrop 2000(ThermoFisher，USA)測定。按照反轉錄試劑盒PrimeScriptTMRT Reagent Kit(Takara，Japan)說明書將RNA反轉錄成cDNA，將得到的cDNA溶液置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2crFTBcDNA部分序列克隆 根據(jù)月季(Rosachinensis)、木薯(Manihotesculenta)和擬南芥等物種FTB基因同源序列設計引物(F：5′-GACAACCACATCGAGTATC-3′和R：5′-GTACTCGAAGTCT-TGGTCCA-3′)。以長春花葉片的cDNA作為模板，擴增crFTB基因部分序列。PCR反應體系為50 μL,包含2.0 μL cDNA、10 μmol/L的上下游引物各1.0 μL、5.0 μL 10×PCR buffer、5.0 μL dNTP Mixture(2.5 mmol/L each)、1.0 μLTaqDNA polymerase (5 U/μL)、35.0 μL ddH2O。反應條件為：96 ℃ 5 min；95 ℃ 60 s，56 ℃ 45 s，72 ℃ 60 s，共30個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。擴增后的PCR產(chǎn)物經(jīng)EasyPure?Quick Gel Extraction Kit(Transgen，China)回收后，按照pEASY-T1 Simple Cloning Kit(Transgen，China)說明書進行連接轉化，陽性菌落送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

1.3.3crFTBcDNA全長克隆 參照Clontech公司SMART?RACE 5′/3′Kit 說明書，以獲得的crFTBcDNA序列為基礎，設計3′端特異性引物GSP3(5′-CCGTCCTTTACGGTTCTGGA-3′)和5′端特異性引物GSP5(5′-CCAGATGAGGCAACTGACCA-3′)及In-fusion克隆引物GSP3N(5′-CGACCTTGGCTTTGCTATTGG-3′)和GSP5N(5′-TCCTGGCAACGCCTAAGAAA-3′)，3′-RACE和5′-RACE反應條件參照說明書。將擴增產(chǎn)物純化并連接pMD18-T(Takara，Japan)，然后篩選陽性克隆進行測序。

1.3.4crFTB的生物信息學分析 對擴增獲得的序列使用Seqman進行拼接；序列同源性比對和相似性分析應用BLAST和ClustalX 1.8軟件進行；應用ProtParam和ORF Finder在線預測氨基酸序列、分子質(zhì)量、理論等電點和開放閱讀框(ORF)等；應用NetNGlyc和NetOGlyc在線分析蛋白質(zhì)氨基酸序列中的N-糖基化位點和O-糖基化位點；應用NetPhos在線分析蛋白質(zhì)氨基酸序列中的磷酸化位點；應用MEGA 5.0建立crFTB與其他物種FTB親緣關系的進化樹。

1.3.5crFTB在葉片組織中的定量表達分析 根據(jù)crFTBcDNA序列設計實時熒光定量PCR引物(F：5′-GGTGGAATAGCTGGGGAACC-3′和R：5′-GAGGCAGGTCCAAACGATGA-3′)，以18S rRNA基因為內(nèi)參(F：5′-GCTTAGGCCAAGGAAGTTTG-3′和R：5′-TCTATCCCCATCACGATGAA-3′)[10]。實時熒光定量PCR以SYBER Green為染料，以1.3.1中cDNA為模板，樣品中目的基因和內(nèi)參基因的Ct值為3次重復的平均值，根據(jù)2-ΔΔCt法進行數(shù)據(jù)分析[11]，數(shù)據(jù)均以mRNA的相對表達量表示，分析crFTB表達模式需以第一次采集的對照樣品的相對表達量進行校正，運用Duncan’s法檢驗分析統(tǒng)計學差異。

2 結果與分析

2.1 crFTBcDNA克隆與分析

利用PCR技術從長春花的cDNA中擴增到了一個長度約450 bp的片段，測序后在GenBank中進行BLAST分析，結果顯示，該序列與已知植物的法尼基轉移酶β-亞基基因FTB的同源性最高。利用RACE技術獲得該基因的3′和5′末端序列，拼接后得到全長為1 826 bp的crFTBcDNA序列，包含150 bp 5′UTR、1 368 bp ORF和308 bp 3′UTR(圖1)，在GenBank中登錄號為MH461106。其ORF編碼455個氨基酸，ProtParam軟件分析其理論分子質(zhì)量和等電點分別為50.45 ku和4.67。經(jīng)NetNGlyc和NetOGlyc軟件預測，crFTB基因編碼的氨基酸序列第94、346位具有2個N-糖基化位點，第31位具有1個O-糖基化位點；該序列還含有酪氨酸磷酸化位點8個，蘇氨酸磷酸化位點6個及絲氨酸磷酸化位點9個。

2.2 crFTB蛋白系統(tǒng)進化分析

BLAST分析顯示，長春花crFTB蛋白與其他已知物種的FTB序列具有較高的同源性，與已公布的油橄欖樟子松變種(Oleaeuropaeavar.sylvestris)和芝麻(Sesamumindicum)的FTB蛋白最高同源性分別為67%和66%。多重比較證實，crFTB具有較好保守性(圖2)，執(zhí)行催化功能的活性位點和Zn2+結合位點的氨基酸殘基保守性高達100%，C端區(qū)域比N端區(qū)域保守性更好。利用MEGA 5.0的Neighbor-joining(N-J)法構建crFTB與其他已知植物FTB序列的系統(tǒng)進化樹，結果顯示，長春花crFTB單獨分成一支，然后與油橄欖樟子松變種、旋蒴苣苔(Dorcocerashygrometricum)等其他植物FTB蛋白聚在一起(圖3)，表明目前已知的FTB氨基酸序列中，長春花和油橄欖樟子松變種的親緣關系最近，這與BLAST的結果完全一致。

2.3 crFTB在CLas感染長春花過程中的時序表達分析

應用實時熒光定量PCR技術分析CLas感染長春花過程中葉片組織內(nèi)crFTB基因的時序表達特點，結果表明，在試驗組(染病植株)和對照組(健康植株)葉片中都能檢測到crFTBmRNA的表達，在染病長春花的葉片中，crFTB基因的表達量呈現(xiàn)先升后降的模式，從4 DAI開始crFTB基因的表達量升高，到24 DAI時達到峰值，然后表達量開始下降，直到試驗結束時仍顯著高于健康植株中crFTB基因的表達量(圖4)。染病長春花的葉片中crFTB基因的表達量在4、8、12、16、20、24、28、32、36、40 DAI時分別是健康植株表達量的3、7、12、14、15、18、13、9、7、5倍。

*：終止密碼子；斜體aataaa：polyA終止信號；□：蛋白質(zhì)的活性位點；__：蛋白質(zhì)的Zn2+結合位點

□：蛋白質(zhì)的活性位點；__：蛋白質(zhì)的Zn2+結合位點

3 結論與討論

在酵母和哺乳動物中，法尼基轉移酶能介導體內(nèi)幾種關鍵調(diào)控蛋白如Ras家族蛋白的轉膜、cGMP的磷酸二酯化、核纖層蛋白及一些蛋白激酶的磷酸化；在植物中，法尼基轉移酶參與細胞周期控制和ABA信號通路的傳導[12]。本研究采用同源克隆和RACE技術獲得長春花法尼基轉移酶β-亞基基因crFTB的cDNA全長序列并進行了分析，結果顯示，crFTB蛋白與油橄欖樟子松變種FTB蛋白同源性最高為67%，氨基酸序列中存在一些非常保守而且又具有重要功能的氨基酸殘基，這表明FTB雖然在不同植物中氨基酸序列有較大差異，但通過折疊后的蛋白質(zhì)高級結構可能完全相同，在不同植物中執(zhí)行的功能也基本類似[13]。

植物遭受不良條件脅迫是制約其生長發(fā)育的主要因素，如病原體的入侵、干旱及鹽堿地等，其中，病原體入侵不僅影響到植物體內(nèi)蛋白質(zhì)合成和代謝，而且直接影響其果實的品質(zhì)和產(chǎn)量的高低。通過現(xiàn)代分子生物學的方法獲得了大量與病原誘導相關的基因，如滲透壓調(diào)節(jié)基因、抗性基因等，其中包含與植物抗性信號傳導相關的法尼基修飾基因及直接參與抵御病原的功能基因[14]。目前研究表明，法尼基轉移酶是生物體內(nèi)參與信號轉導蛋白法尼基修飾的主要功能酶，該酶由α和β 2個亞基構成，其中α-亞基負責與蛋白質(zhì)底物結合和法尼基修飾過程中的轉移反應，β-亞基則負責蛋白質(zhì)底物的特異性識別[15]。在擬南芥中，法尼基轉移酶β-亞基FTB已被證實是調(diào)節(jié)ABA信號的負調(diào)控因子，當植株處于不良環(huán)境中，可以通過降低ABA濃度改變?nèi)~片氣孔直徑，調(diào)控植物體內(nèi)的信號分子濃度，從而增加植物的抗逆性[16]。然而，F(xiàn)TB在其他植物中的具體功能仍不明晰。為研究FTB在長春花遭受CLas脅迫下的表達情況，本試驗選取病原侵染后不同時間點長春花葉片組織的RNA，運用熒光定量PCR檢測crFTB表達水平和變化趨勢，結果表明，crFTB在CLas侵染后長春花葉片中的表達量隨感染時間呈現(xiàn)先升后降的趨勢，試驗組從8 DAI起至試驗結束其表達水平均顯著高于對照組。分析認為，在試驗早期(嫁接時間小于8 DAI時)，嫁接的病芽中CLas進行繁殖并逐漸轉移至長春花，寄主體內(nèi)的crFTB表達量開始上升；當CLas大量入侵長春花時(嫁接時間為8～24 DAI)，crFTB為幫助寄主植物抵抗CLas的感染其表達量顯著性升高；而當CLas已經(jīng)感染寄主植物(嫁接時間大于24 DAI)后，crFTB表達量開始下降。寄主體內(nèi)crFTB的表達量逐步上升，從而提高寄主對抗病原入侵的能力，說明crFTB確實在寄主抵抗CLas侵染過程中起重要作用。

圖3 N-J法構建的FTB家族成員氨基酸序列系統(tǒng)進化樹Fig.3 A phylogenetic tree of FTB family members based on amino acid sequences constructedwith the neighbor-joining method

*:差異顯著(P<0.05)；**:差異極顯著(P<0.01)

長春花為柑橘黃龍病研究中重要的指示植物和試驗材料，本研究對其crFTB基因進行克隆及生物信息學分析，并通過人工嫁接的方式感染黃龍病菌后，探討長春花葉片中crFTB在病原感染不同時間點的表達量變化，旨在進一步探索crFTB基因的功能以及其在長春花對抗黃龍病菌侵染中的作用，為研究CLas與柑橘寄主的互作提供參考。