張仁森，劉秋月，潘林香，王金文，王翔宇，胡文萍，馬 琳，狄 冉，儲(chǔ)明星

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，農(nóng)業(yè)部動(dòng)物遺傳育種與繁殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193；2.萊蕪市嬴泰有機(jī)農(nóng)業(yè)科技發(fā)展有限公司，山東 萊蕪271114；3.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，濟(jì)南 250100）

家畜的產(chǎn)（羔）仔數(shù)是一種重要的經(jīng)濟(jì)性狀，提高產(chǎn)（羔）仔數(shù)對(duì)于提高畜牧業(yè)產(chǎn)值具有重要意義［1］。綿羊產(chǎn)羔數(shù)是一種數(shù)量性狀，受多基因調(diào)控，而其遺傳力僅為0.1左右［2］，因此通過常規(guī)育種技術(shù)提高綿羊產(chǎn)羔數(shù)耗時(shí)極長，效率低下。標(biāo)記輔助選擇可以通過影響選擇的時(shí)間、強(qiáng)度以及準(zhǔn)確性來極大地提高這類低遺傳力性狀的選擇效率［3］。因此，尋找影響綿羊產(chǎn)羔數(shù)的分子遺傳標(biāo)記是實(shí)現(xiàn)綿羊產(chǎn)羔數(shù)標(biāo)記輔助選擇的先決條件。

全基因組重測序是目前挖掘功能基因的一種重要方式［4-8］。本實(shí)驗(yàn)室前期對(duì)10個(gè)綿羊品種的99個(gè)個(gè)體進(jìn)行全基因組重測序，定義Z（Fst）＞5為顯著位點(diǎn)，篩選獲得可能與綿羊產(chǎn)羔數(shù)相關(guān)的候選基因HIRA（Histone cell cycle regulator）及其突變位點(diǎn)（g.71874104 G＞A及g.71833755 T＞C，其中g(shù).71874104 G＞A位點(diǎn)位于啟動(dòng)子上游區(qū)域，g.71833755 T＞C位點(diǎn)位于內(nèi)含子區(qū)域，該位點(diǎn)突變導(dǎo)致在該位置的氨基酸從親水性谷氨酰胺變?yōu)閴A性精氨酸），其Z（Fst）值為7.1，提示該基因可能與綿羊產(chǎn)羔數(shù)相關(guān)。HIRA是一種組蛋白調(diào)節(jié)基因，它位于綿羊17號(hào)染色體上，由27個(gè)外顯子和26個(gè)內(nèi)含子組成，編碼1 091個(gè)氨基酸，其產(chǎn)物HIR/HIRA是組蛋白伴侶蛋白，其主要功能是輔助組蛋白完成核小體的解聚和重新裝配，從而參與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、基因沉默、細(xì)胞衰老等多種生物學(xué)過程［9］。HIRA的基因產(chǎn)物包含著一組保守的蛋白家族，在多種生物體如酵母、果蠅、小鼠、人類以及植物等中都有發(fā)現(xiàn)［10-11］，其對(duì)維持基因組的完整性以及細(xì)胞穩(wěn)態(tài)具有重要作用［12］。HIRA基因首先在酵母中發(fā)現(xiàn)［13］，隨后對(duì)HIRA基因的研究越來越多。研究發(fā)現(xiàn)，HIRA與異染色質(zhì)區(qū)域的沉默和假轉(zhuǎn)錄本的抑制等有關(guān)，其缺失或突變會(huì)導(dǎo)致胚胎發(fā)育障礙、雌性不育等多種生理缺陷［14-19］。目前未見HIRA基因與魯中肉羊產(chǎn)羔數(shù)之間關(guān)系的研究報(bào)道。

魯中肉羊原產(chǎn)山東萊蕪，是利用肉用性能好的白頭杜泊羊與繁殖率高的湖羊雜交育種而成，具有增重快、料肉比高、抗粗飼、抗病、適合圈養(yǎng)等特點(diǎn)［20］。本研究以魯中肉羊?yàn)閷?duì)象，利用實(shí)驗(yàn)室前期重測序結(jié)果結(jié)合Sequenom MassARRAY?SNP技術(shù)對(duì)其HIRA基因g.71874104 G＞A和g.71833755 T＞C位點(diǎn)進(jìn)行分型，探討魯中肉羊HIRA基因SNP位點(diǎn)的多態(tài)性，并分析其與魯中肉羊產(chǎn)羔數(shù)的關(guān)聯(lián)性，為魯中肉羊產(chǎn)羔數(shù)的分子標(biāo)記輔助育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 血樣采集及數(shù)據(jù)測定

試驗(yàn)所用384只魯中肉羊血樣采自山東省萊蕪市嬴泰有機(jī)農(nóng)業(yè)科技發(fā)展有限公司。羊只營養(yǎng)以及管理水平均保持一致，年齡相近。采取頸靜脈采血，檸檬酸葡萄糖抗凝，-20℃保存。同時(shí)記錄其產(chǎn)羔季節(jié)、胎次與產(chǎn)羔數(shù)。

1.2 DNA提取

魯中肉羊血液樣本DNA使用TIANGEN（天根）血液DNA試劑盒提取，使用Nano Drop2000檢測DNA樣本濃度，DNA質(zhì)量使用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。

1.3 基因分型

對(duì)HIRA基因2個(gè)多態(tài)位點(diǎn)在魯中肉羊中進(jìn)行基因分型，采用Sequenom MassARRAY?SNP技術(shù)進(jìn)行基因型檢測［21］。分型樣品為DNA，每個(gè)樣品需要量為20 μL，DNA 濃度為 40～80 ng/μL。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2016軟件統(tǒng)計(jì)魯中肉羊HIRA基因2個(gè)多態(tài)位點(diǎn)基因型頻率、等位基因頻率、多態(tài)信息含量、雜合度和有效等位基因數(shù)，并進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)。產(chǎn)羔數(shù)關(guān)聯(lián)分析如本實(shí)驗(yàn)室田志龍等［22］之前所述，采用SPSS19.0軟件程序中一般線性模型完成魯中肉羊基因型與產(chǎn)羔表型數(shù)據(jù)關(guān)聯(lián)分析，所有數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 HIRA基因多態(tài)性分析

根據(jù)基因分型結(jié)果，發(fā)現(xiàn)魯中肉羊HIRA基因g.71833755 T>C位點(diǎn)存在TT、TC和CC三種基因型

圖1 HIRA基因g.71833755 T＞C位點(diǎn)分型結(jié)果

對(duì)上述2個(gè)位點(diǎn)在魯中肉羊中的基因型頻率和等位基因頻率分別進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)，并計(jì)算上述2個(gè)位點(diǎn)在群體中的多態(tài)信息含量、雜合度和有效等位基因數(shù)，并用卡方檢驗(yàn)檢測2個(gè)位點(diǎn)在群體中的平衡狀態(tài)，結(jié)果見表1。

圖2 HIRA基因g.71874104 G＞A位點(diǎn)分型結(jié)果

從表1可知，魯中肉羊HIRA基因g.71833755 T>C（圖1），g.71874104 G>A位點(diǎn)存在AA、AG和GG三種基因型（圖 2）。位點(diǎn)在魯中肉羊中表現(xiàn)為低度多態(tài)（PIC<0.25），g.71874104 G>A位點(diǎn)在魯中肉羊中表現(xiàn)為中度多態(tài)（0.25C位點(diǎn)在魯中肉羊中處于哈代溫伯格不平衡狀態(tài)（P<0.05），g.71874104 G>A位點(diǎn)在魯中肉羊中處于哈代溫伯格平衡狀態(tài)（P>0.05）。

表1 HIRA基因2個(gè)多態(tài)位點(diǎn)的群體遺傳學(xué)分析

2.2 HIRA基因g.71833755T>C位點(diǎn)和g.71874104 G>A位點(diǎn)與魯中肉羊產(chǎn)羔數(shù)的關(guān)系

從表2可以初步得出，HIRA基因g.71874104 G>A位點(diǎn)多態(tài)性與魯中肉羊第2胎、第3胎產(chǎn)羔數(shù)顯著關(guān)聯(lián)（P<0.05），雜合型AG個(gè)體各胎產(chǎn)羔數(shù)均高于野生型GG和突變純合型AA個(gè)體，其中AG型個(gè)體第2胎產(chǎn)羔數(shù)顯著高于AA型個(gè)體（P<0.05），第3胎產(chǎn)羔數(shù)顯著高于GG型個(gè)體；g.71833755 T>C位點(diǎn)多態(tài)性與魯中肉羊第2胎產(chǎn)羔數(shù)顯著關(guān)聯(lián)（P<0.05），雜合型TC個(gè)體第2胎產(chǎn)羔數(shù)均高于野生型TT（P>0.05）和突變純合型CC個(gè)體（P<0.05）。

表2 HIRA基因不同位點(diǎn)各基因型魯中肉羊產(chǎn)羔數(shù)最小二乘均值及標(biāo)準(zhǔn)誤 只

3 討論

3.1 HIRA基因多態(tài)性分析及其與動(dòng)物胚胎成活率之間的關(guān)系

HIRA基因g.71833755 T>C與g.71874104 G>A位點(diǎn)在NCBI中已有報(bào)道，但這兩個(gè)位點(diǎn)與魯中肉羊產(chǎn)羔數(shù)關(guān)聯(lián)分析方面未有文獻(xiàn)報(bào)道。群體多態(tài)信息含量分析發(fā)現(xiàn)，g.71874104 G＞A位點(diǎn)在魯中肉羊中處于中度多態(tài)（0.25＜PIC＜0.5），表明該位點(diǎn)在魯中肉羊中存在較強(qiáng)的選擇潛力；而g.71833755 T＞C位點(diǎn)在魯中肉羊中表現(xiàn)為低度多態(tài)（PIC＜0.25），表明該位點(diǎn)在魯中肉羊中選擇潛力較小。可見，不同位點(diǎn)在同一綿羊品種中受到的選擇強(qiáng)度不同?？ǚ竭m合性檢驗(yàn)結(jié)果表明，g.71874104 G＞A位點(diǎn)在魯中肉羊中處于哈代溫伯格平衡狀態(tài)（P＞0.05），表明經(jīng)過長期進(jìn)化和選擇，該位點(diǎn)在適應(yīng)性方面具有一定的遺傳優(yōu)勢；而g.71833755 T＞C位點(diǎn)在魯中肉羊中處于哈代溫伯格不平衡狀態(tài)（P＜0.05），這可能是因?yàn)樵撐稽c(diǎn)受地域差異或者人工選擇的影響較大，也可能是因?yàn)樗褂玫臉颖緮?shù)偏少造成的。

排卵數(shù)和胚胎成活率是影響產(chǎn)羔數(shù)的重要指標(biāo)［23］。在實(shí)際生產(chǎn)實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)胚胎數(shù)目多并不一定意味著實(shí)際的產(chǎn)羔數(shù)一定多。周梅等［24］研究發(fā)現(xiàn)，部分小尾寒羊母羊能夠產(chǎn)生4～5個(gè)胚胎，然而最終的產(chǎn)羔數(shù)卻只有2～3 個(gè)。Dilg 等［25］和 Pchelintsev 等［26］研究表明，HIRA基因的突變是導(dǎo)致胚胎死亡的重要因素。王玉鳳等［27］研究發(fā)現(xiàn)，果蠅中過表達(dá)的dHira將會(huì)影響與細(xì)胞周期有關(guān)的基因表達(dá)，使早期胚胎的細(xì)胞核分裂不能同步，進(jìn)而導(dǎo)致果蠅早期胚胎的大量死亡。王孟雨等［28］研究了HIRA敲除對(duì)銀鯽胚胎發(fā)育的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HIRA的敲除會(huì)導(dǎo)致銀鯽體節(jié)發(fā)育異常、循環(huán)系統(tǒng)障礙、圍心腔水腫等胚胎發(fā)育異?，F(xiàn)象，且伴隨著出苗后魚苗的大量死亡現(xiàn)象。Roberts等［18］研究發(fā)現(xiàn)，HIRA的突變會(huì)影響小鼠中內(nèi)胚層的發(fā)育和分化，導(dǎo)致脊索、神經(jīng)管及心臟回路發(fā)育缺陷，甚至導(dǎo)致胚胎在孕中期死亡。Nashun等［29］研究發(fā)現(xiàn)，HIRA的缺失會(huì)導(dǎo)致小鼠原始卵泡細(xì)胞的嚴(yán)重發(fā)育缺陷以及大量的卵母細(xì)胞死亡。Clift等［30］研究發(fā)現(xiàn)，HIRA的缺失會(huì)影響小鼠基因組中的核小體裝配過程，導(dǎo)致無法形成雄性原核。Lin等［31］研究發(fā)現(xiàn)，HIRA突變的雌性小鼠能夠正常排卵，但其在與野生型雄性交配后無法產(chǎn)生后代。然而在本研究中，HIRA基因 g.71874104 G＞A位點(diǎn)和g.71833755 T＞C位點(diǎn)突變均不會(huì)導(dǎo)致母羊不育，且二者的突變雜合子在魯中肉羊中產(chǎn)羔數(shù)均最高，表明這兩個(gè)位點(diǎn)突變雜合子母羊產(chǎn)生的卵子能夠參與正常的受精過程，且形成的合子可能具有最強(qiáng)的胚胎發(fā)育能力，這與前人在其他物種中的研究結(jié)果并不一致。推測這可能與物種之間的差異有關(guān)，具體原因需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證明。

3.2 HIRA基因多態(tài)性與魯中肉羊產(chǎn)羔數(shù)之間的關(guān)系

關(guān)聯(lián)分析表明，g.71874104 G＞A和g.71833755 T＞C位點(diǎn)的突變對(duì)魯中肉羊產(chǎn)羔數(shù)影響較大，這與Zhou等［32］在小尾寒羊中的研究結(jié)果相一致。在Ensemble數(shù)據(jù)庫中查找發(fā)現(xiàn)g.71874104 G＞A位點(diǎn)位于HIRA基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游255 bp處，因此，很有可能該突變位點(diǎn)位于HIRA基因的啟動(dòng)子區(qū)域，推測該位點(diǎn)的突變可能通過影響HIRA基因轉(zhuǎn)錄從而最終影響魯中肉羊的產(chǎn)羔數(shù)，這需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證明。研究表明，動(dòng)物的表型性狀可因?yàn)榛蚰承┪稽c(diǎn)的突變而顯著改變［33-35］。g.71833755 T＞C位點(diǎn)突變導(dǎo)致在該位置的氨基酸從親水性谷氨酰胺變?yōu)閴A性精氨酸，但是該突變是如何影響魯中肉羊產(chǎn)羔數(shù)性狀的有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

HIRA基因g.71874104 G＞A位點(diǎn)多態(tài)性與魯中肉羊第2胎、第3胎產(chǎn)羔數(shù)顯著關(guān)聯(lián)；g.71833755 T＞C位點(diǎn)多態(tài)性與魯中肉羊第2胎產(chǎn)羔數(shù)顯著關(guān)聯(lián)。綜上，g.71874104 G＞A位點(diǎn)的A等位基因及g.71833755 T＞C位點(diǎn)的C等位基因可能是提高綿羊產(chǎn)羔數(shù)潛在有效的DNA標(biāo)記。