文禹粱 ，潘林香 ，王金文 ，馬 琳 ，趙生國 ，儲明星

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，農(nóng)業(yè)部動物遺傳育種與繁殖重點實驗室，北京 100193；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，蘭州 730070；3.萊蕪市嬴泰有機(jī)農(nóng)業(yè)科技發(fā)展有限公司，山東萊蕪 271114；4.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，濟(jì)南 250100）

綿羊產(chǎn)羔數(shù)作為重要的經(jīng)濟(jì)性狀，是影響綿羊產(chǎn)業(yè)經(jīng)濟(jì)效益的重要因素之一［1］。綿羊產(chǎn)羔數(shù)性狀遺傳力只有0.1左右，若僅依靠傳統(tǒng)的雜交育種和自然選擇，每個世代僅可提高2%的產(chǎn)羔數(shù)，效率極低［2］。利用分子標(biāo)記輔助選擇（Marker assisted selection，MAS）則可極大地提高低遺傳力性狀的選擇功效。隨著人們對綿羊產(chǎn)羔性狀的深入研究，陸續(xù)發(fā)現(xiàn)骨形態(tài)發(fā)生蛋白受體1B（Bone morphogenetic protein receptor1B，BMPR1B）、骨形態(tài)發(fā)生蛋白 15（Bone morphogenetic protein 15，BMP15）以及生長分化因子9（Growth differentiation factor 9，GDF9）等是影響綿羊產(chǎn)羔數(shù)的主效基因［3］。其中BMPR1B和BMP15都是轉(zhuǎn)化生長因子-β（Transforming growth factor-β，TGF-β）超家族最大的亞家族BMP家族（Bone morphogenetic protein family）中的重要基因［4］。BMP 家族廣泛作用于綿羊卵巢生殖細(xì)胞（卵泡、黃體、卵母細(xì)胞以及顆粒細(xì)胞），并通過旁/自分泌對早期胚胎和卵泡發(fā)育起重要調(diào)節(jié)作用［5-6］。

BMP4是BMP家族成員，最初被稱為BMP-2b。Wozney等［7］首先克隆得到其在人體的序列。綿羊BMP4基因位于7號染色體，包括6個外顯子，編碼區(qū)全長1 229 bp，編碼 409 個氨基酸［8］。研究表明，BMP4為綿羊生殖所必需，具有調(diào)節(jié)動物卵泡發(fā)育、促進(jìn)顆粒細(xì)胞增殖、卵丘擴(kuò)散以及促進(jìn)卵母細(xì)胞成熟和排卵等功能［9］。張弛等［10］研究發(fā)現(xiàn)，BMP4可促進(jìn)排卵卵泡中顆粒細(xì)胞分化，排卵數(shù)增加。本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)，小尾寒羊BMP4基因外顯子3第305位堿基發(fā)生C/A突變。該突變的BB型小尾寒羊平均產(chǎn)羔數(shù)比AB型和AA型多0.61只，與小尾寒羊產(chǎn)羔數(shù)呈加性效應(yīng)［11］。另外，本實驗室前期對10個綿羊品種進(jìn)行全基因組重測序發(fā)現(xiàn)，基于Oar_3.1版本綿羊BMP4基因編碼區(qū)存在一個錯義突變位點 g.63454744T＞G［12］。因此，本研究對BMP4基因g.63454744T＞G位點采用Sequenom MassARRAY?SNP技術(shù)在隨機(jī)群體中分型，與魯中肉羊產(chǎn)羔數(shù)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，探討B(tài)MP4多態(tài)性對魯中肉羊產(chǎn)羔數(shù)的影響，為進(jìn)一步開展綿羊產(chǎn)羔機(jī)理研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 血樣及數(shù)據(jù)采集

從山東省萊蕪市嬴泰有機(jī)農(nóng)業(yè)科技發(fā)展有限公司隨機(jī)采集384只在2～3歲之間的魯中肉羊頸靜脈血10 mL，檸檬酸葡萄糖抗凝處理后-20℃保存。并收集384只魯中肉羊的產(chǎn)羔數(shù)表型數(shù)據(jù)。

1.2 DNA提取

采用DNA提取試劑盒（天根公司，北京）提取試驗綿羊血液DNA。利用Nanodrop2000微量分光光度計（Nano Drop Technologies，美國）檢測提取DNA樣本濃度，用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳對DNA質(zhì)量進(jìn)行檢測。

1.3 基因分型

利用Sequenom MassARRAY?SNP結(jié)合多重PCR技術(shù)、MassARRAY Iplex單堿基延伸技術(shù)和基質(zhì)輔助激光解吸附電離飛行時間質(zhì)譜分析質(zhì)譜技術(shù)（Matrix assisted laser desorption/ionization time of flight，MALDITOF）對BMP4基因g.63454744T＞G位點進(jìn)行分型。分型的具體步驟參考馬曉萌等［13］的方法。分型樣品為DNA，濃度 40～80 ng/μL，每個樣品量 20 μL。

1.4 數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用 Microsoft Excel 2016（Microsoft Excel，美國）軟件統(tǒng)計綿羊BMP4基因g.63454744T＞G位點的基因型頻率、等位基因頻率、多態(tài)信息含量（PIC）、雜合度（He）和有效等位基因數(shù)（Ne），計算公式參考 Guo 等［14］的方法，隨后進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡檢驗。使用最小二乘法進(jìn)行魯中肉羊BMP4不同基因型之間的產(chǎn)羔數(shù)分析，所建立的線性模型為：

式中，yijkl為產(chǎn)羔數(shù)的記錄值；μ為群體平均值；LSi為第i個產(chǎn)羔季節(jié)的固定效應(yīng)；Pj為第j個胎次的固定效應(yīng)；Gk為BMP4基因第k種基因型的固定效應(yīng)；eijkl為隨機(jī)殘差效應(yīng)。使用SPSS 19.0軟件進(jìn)行魯中肉羊基因型與產(chǎn)羔表型數(shù)據(jù)關(guān)聯(lián)分析，所有數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 BMP4基因多態(tài)性分析

分型發(fā)現(xiàn)，BMP4基因g.63454744 T＞G位點在魯中肉羊中存在3種基因型，分別為野生純合型TT、雜合型GT和突變純合型GG，見圖1。

BMP4基因g.63454744 T＞G位點3種基因型TT、GT、GG頻率分別為0.38、0.53和0.09。卡方適合性檢驗結(jié)果表明，該位點在魯中肉羊中處于哈代溫伯格不平衡狀態(tài)（P＜0.01），說明魯中肉羊群體中受到人工選擇。該位點在魯中肉羊中的多態(tài)信息含量為0.35，表現(xiàn)為中度多態(tài)（0.25

2.2 BMP4基因g.63454744 T＞G位點與魯中肉羊產(chǎn)羔數(shù)的關(guān)系

由表1可知，魯中肉羊前三胎產(chǎn)羔數(shù)都是TT>GT>GG，但差異均未達(dá)到顯著水平（P>0.05）。

圖1 BMP4基因分型結(jié)果

表1 BMP4基因g.63454744 T＞G位點各基因型小尾寒羊產(chǎn)羔數(shù)最小二乘均值及標(biāo)準(zhǔn)誤 只

3 討論

BMP4可以促進(jìn)哺乳動物卵泡發(fā)育和成熟。Shimasaki等［15］認(rèn)為，BMP4是格拉夫卵泡發(fā)育中的黃體化抑制因子。有研究發(fā)現(xiàn)，BMP4在小鼠體內(nèi)或者體外添加都可以促進(jìn)初級卵泡轉(zhuǎn)化為次級卵泡［16］。BMP4可促進(jìn)牛卵巢原始卵泡以及次級卵泡直徑的增加，并調(diào)控牛卵母細(xì)胞成熟［5］。又有研究表明，BMP4可誘導(dǎo)增加顆粒細(xì)胞對FSH的敏感性，調(diào)控FSH依賴的雌激素和孕酮合成［15-17］。徐業(yè)芬等［18］研究發(fā)現(xiàn)，BMP4抗體處理后的湖羊卵母細(xì)胞出現(xiàn)凋亡并消失，表明BMP4是原始卵泡和卵母細(xì)胞生存的必需因子，可促進(jìn)卵泡顆粒細(xì)胞進(jìn)一步分化，排卵卵泡進(jìn)一步成熟，最終表現(xiàn)為排卵數(shù)增加。前期本實驗室研究發(fā)現(xiàn)［19］，BMP4基因在濟(jì)寧青山羊、波爾山羊、安哥拉山羊以及內(nèi)蒙古絨山羊中檢測出3種基因型（CC、CD和DD型），濟(jì)寧青山羊CC基因型產(chǎn)羔數(shù)比CD以及DD型多0.55只（P<0.05）或0.72只（P<0.05），揭示了BMP4等位基因C可能是提高山羊產(chǎn)羔數(shù)的潛在DNA標(biāo)記。孫振梅等［20］研究發(fā)現(xiàn)，BMP4基因在多羔黔北麻羊表達(dá)量顯著高于單羔黔北麻羊（P<0.05）。Faure等［21］研究發(fā)現(xiàn)，BMP4基因在多羔組羅姆尼綿羊子宮、下丘腦、垂體、卵巢中的表達(dá)量均極顯著高于單羔組（P<0.01）。這與BMP4參與哺乳動物卵泡發(fā)育和排卵相關(guān)，提示BMP4基因表達(dá)可能與綿羊高繁殖力有關(guān)。

研究表明，基因位點的突變可顯著改變動物表型性狀。1982年，Davis等在高繁殖力布魯拉美利奴羊中發(fā)現(xiàn)，常染色體的某個基因增加一個拷貝突變將導(dǎo)致母羊排卵數(shù)增加1.65個［22］。而該突變就是在BMPR1B基因編碼區(qū)A746G的突變，該突變導(dǎo)致蛋白質(zhì)序列中的第249位的谷氨酰胺被置換為精氨酸（Q249R）［23-24］。其突變后增加了信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程對下游受體的信號強(qiáng)度，導(dǎo)致卵泡早熟，排卵數(shù)增加［25］。BMP4基因g.63454744 T＞G位點發(fā)生在基因編碼區(qū)T429G的突變，該突變導(dǎo)致蛋白序列中第100位的天冬酰胺被置換為組氨酸。BMP4基因g.63454744 T＞G位點的突變降低了魯中肉羊的產(chǎn)羔數(shù)，可能是因為該突變降低了BMP4信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程對下游受體的信號強(qiáng)度，從而延緩卵泡發(fā)育，減少排卵數(shù)。關(guān)于具體的調(diào)控機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

本研究表明，BMP4基因g.63454744 T＞G位點在魯中肉羊中存在3種基因型，但其與魯中肉羊各胎次產(chǎn)羔數(shù)之間沒有顯著關(guān)聯(lián)，該位點不適合用于魯中肉羊產(chǎn)羔性狀選育。