李雪賢，李 敏，陳 述，張瑞濤，劉 冰，吳帥帥，于 杰

（國家膠類中藥工程技術(shù)研究中心，東阿阿膠股份有限公司，山東 東阿 252201）

德州驢，是我國本土五大驢種之一［1］，具有體格高 大、結(jié)構(gòu)勻稱、役肉兼用的特點，也是驢種改良及種間雜交的理想品種［2］。近年來，消費者對驢產(chǎn)品的需求量逐漸增加，但毛驢存欄量持續(xù)下降，加之落后的繁殖技術(shù)，已經(jīng)嚴(yán)重制約了驢產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。而在馬［3］、牛［4］、羊［5］上，冷凍精液與人工授精技術(shù)的結(jié)合，不僅推動了群體的遺傳改良，還極大地提高了牛奶、羊毛等的產(chǎn)量。現(xiàn)階段，驢繁殖多采用本交的方式，人工繁殖技術(shù)研究相對較少。種公驢精液品質(zhì)的優(yōu)劣，是其種用價值的直觀指標(biāo)，直接影響母畜的受胎率和群體的繁殖率。已有研究表明，多種因素影響種公驢的精液品質(zhì)，如季節(jié)、體尺、性行為等［6-7］，但年齡對種公驢精液品質(zhì)影響的研究鮮有報道。本研究充分利用已有數(shù)據(jù)，著重分析、討論年齡與種公驢精液品質(zhì)的關(guān)系，旨在確定種公驢精液采集的最適年齡范圍，為最大限度地發(fā)揮優(yōu)良種公驢的生產(chǎn)性能、合理制定種公驢的更新年限提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物及飼養(yǎng)管理

本研究選取中國東阿國家黑毛驢繁育中心的42頭4～7歲種公驢，對其2018年上半年的采精狀況及生產(chǎn)數(shù)據(jù)進行跟蹤與統(tǒng)計分析。種公驢的飼養(yǎng)管理按照繁育中心飼養(yǎng)管理技術(shù)規(guī)程進行，采用自由飲水、“三定”原則、“先粗后精”的飼喂方式，給予自然光照和安靜、衛(wèi)生的圈舍環(huán)境。種公驢采精前先進行調(diào)教，“空采”兩輪后使用，保證精液質(zhì)量［7］。

1.2 試驗材料與試劑

假陰道，集精杯，恒溫水浴鍋，量筒，顯微鏡，載玻片，蓋玻片，精液密度測定儀，自制冷凍液，精液分裝打印一體機，程序冷凍儀，精液數(shù)位分析系統(tǒng)，等等。

1.3 試驗設(shè)計

將種公驢的生產(chǎn)數(shù)據(jù)按采精年齡分為4組：4歲組、5歲組、6歲組及7歲組。本研究共收集并整理42頭種公驢2018年3—7月共計140 d的采精數(shù)據(jù)，剔除前兩次“空采”記錄后，對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

1.4 精液樣品的采集、測定指標(biāo)及測定方法

使用消毒后的假陰道刺激法進行精液采集，收集精液至集精杯中，稱量體積，記錄射精量。移液槍取7μL原精，顯微鏡下觀察精子狀態(tài)，并使用精液數(shù)位分析系統(tǒng)測量精子活力，記錄快速向前運動的精子數(shù)，計算其所占百分比。使用精液密度測定儀檢測原精中精子密度。向原精液中按1∶1的比例加入商用稀釋液，1 850 r/min，離心10 min，棄上清液。用精液冷凍保存液重懸精子［8］，使用細(xì)管灌裝打印機分裝精液至0.5 mL凍精細(xì)管中，4℃冷藏柜中平衡2～3 h，用全自動程序冷凍儀快速冷凍精子，并投入液氮中長期保存。每批冷凍樣品均進行解凍復(fù)檢，檢測精子解凍活力，計算復(fù)蘇率。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

所有數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示。采用SPSS 20.0軟件中的單因素方差分析（One-way ANOVA）以及鄧肯（Duncan）多重比較對所得數(shù)據(jù)進行顯著性檢驗，當(dāng)P＜0.05時，認(rèn)為差異顯著。采用SPSS 20.0軟件中的相關(guān)性分析對所得數(shù)據(jù)進行相關(guān)性分析，當(dāng)P＜0.01時，表示具有極顯著相關(guān)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同采精年齡對種公驢總精液量的影響

如圖1所示，以6歲組的種公驢精液采集量為最高，均值超過65 mL，且顯著高于4歲組（P＜0.05）和5歲組（P＜0.05）。7歲組的總精液量有所下降，但與6歲組并不存在顯著性差異（P＞0.05），與4歲組和5歲組間差異顯著（P＜0.05）。

圖1不同采精年齡下種公驢的總精液量

2.2 不同采精年齡對種公驢精子密度的影響

如圖2所示，種公驢精液中精子密度隨著采精年齡的增加而逐漸下降。當(dāng)采精年齡為4歲組和5歲組時，種公驢精子密度的平均值之間并無顯著差異（P＞0.05），但二者均顯著高于6歲組（P＜0.05）和7歲組的精子密度（P＜0.05）；而在采精年齡為6歲組和7歲組的精液中，精子密度差異并不顯著（P＞0.05）。

圖2不同采精年齡下種公驢精液中的精子密度

2.3 不同采精年齡對種公驢精子活力的影響

由表1可知，種公驢采精年齡并不影響精子的原精活力，各組精子活力不存在顯著性差異（P＞0.05）；而經(jīng)過冷凍再解凍后，精子活力呈現(xiàn)升高趨勢，當(dāng)采精年齡為6歲和7歲時，精子的凍后活力均顯著高于4歲組（P＜0.05）和 5歲組（P＜0.05），但二者之間并無顯著性差異（P＞0.05）；采精年齡為5歲時，精子的凍后活力略高于4歲組，但差異不顯著（P＞0.05）。

表1不同采精年齡對種公驢精子活力的影響

2.4 不同采精年齡對種公驢精子冷凍復(fù)蘇率的影響

如圖3所示，隨著采精年齡的增加，種公驢精子冷凍后再復(fù)蘇的合格率逐漸增加。當(dāng)采精年齡為6歲組時，精子的冷凍復(fù)蘇率超過80%，顯著高于4歲組（P＜0.05）和 5歲組（P＜0.05），略高于 7歲組，但差異并不顯著（P＞0.05）；而4歲組和5歲組均顯示較低的復(fù)蘇率，且二者之間并無顯著性差異（P＞0.05）。

圖3不同采精年齡下種公驢精子的冷凍復(fù)蘇率

2.5 采精年齡與種公驢精液各指標(biāo)之間的相關(guān)性

由表2可知，種公驢的采精年齡與精液總量、凍后活力和復(fù)蘇率均呈極顯著的正相關(guān)性（P＜0.01），與精子密度則呈顯著的負(fù)相關(guān)性（P＜0.05）。此外，總精液量與精子密度之間、凍后活力與復(fù)蘇率之間均存在極顯著的相關(guān)性（P＜0.01），而原精活力與精子密度也存在顯著的相關(guān)性（P＜0.05）。

表2采精年齡與精液各指標(biāo)之間的相關(guān)性

3 討論

德州驢12～15月齡即可達(dá)到性成熟，24～36月齡達(dá)到體成熟，生產(chǎn)中一般在2.5歲時開始調(diào)教采精［9］，3～8歲是種公驢一般使用的年齡范圍。但以往的研究發(fā)現(xiàn)，雖然剛剛性成熟的公畜就能夠射出具有受精能力的精液，但是其不完善的組織、器官和身體機能，阻礙了它精液質(zhì)量的提升，而且過早使用種公畜，會導(dǎo)致其過分疲勞，爬跨無力［10］；而種公畜使用年限太長，生殖器官機能衰退，又可能降低精液品質(zhì)，影響母畜受孕率［11］。因此，明確采精年齡對種公畜精液各項指標(biāo)的具體影響就顯得至關(guān)重要。

已有報道指出，種公畜的年齡與精液質(zhì)量密切相關(guān)。Travi等［12］研究發(fā)現(xiàn)，公牛的精液產(chǎn)量和質(zhì)量會隨著年齡的增長而提高。Ahmad等［13-14］報道，相比青年和老年公牛，壯齡種公牛具有更強的性欲，更大的射精量。在本研究中，隨著采精年齡的增長，種公驢采集的總精液量逐漸增加，以6歲組為最高，均值超過65 mL，且顯著高于 4歲組（P＜0.05）和 5歲組（P＜0.05）。但是較大的射精量并不一定表明它具有更高的精子濃度。David等［15］研究發(fā)現(xiàn)，種公羊的精子密度在2～3歲時即達(dá)到最大，此后隨年齡增長而逐漸下降。這與本研究的結(jié)果相一致，種公驢精液中精子密度隨著采精年齡的增加而逐漸下降，4歲組和5歲組的精子密度均顯著高于6歲組（P＜0.05）和 7歲組（P＜0.05），與射精總量呈現(xiàn)相反的趨勢。將種公驢總精液量和精子密度進行相關(guān)性分析可知，二者呈極顯著的負(fù)相關(guān)性（P＜0.01）。進一步研究發(fā)現(xiàn)，年齡處于壯齡的種公畜，精液中活精子百分比最高且畸形率最低［5，16］。說明雖然種公驢精液中精子密度較小，但是可能具有較多的有效精子數(shù)。而隨著年齡增長，上升的總精液量和下降的精子密度，共同維持了穩(wěn)定的總精子數(shù)。

一般認(rèn)為，精子活力是精液中進行前進運動精子所占的百分率。已有研究指出，隨著年齡的增長，種公畜精子活力會呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢［17-18］。然而 Joshi等［19］的研究結(jié)果表明，種公畜年齡的大小對其精子活力并未產(chǎn)生顯著影響。但在家禽上的研究表明，與成年家禽對比，青年家禽的精子質(zhì)量更差，對凍融過程中的溫度變化更敏感［20］。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著年齡的增長，種公驢的原精活力略有下降，但幾個年齡段之間并不存在顯著差異（P＞0.05），而精子的凍后活力和冷凍復(fù)蘇率卻隨著年齡的增長而顯著上升（P＜0.05），且二者與年齡之間均存在極顯著的相關(guān)性（P＜0.01）。該研究結(jié)果提示，隨著種公驢年齡的增長，其精子整體質(zhì)量變好，對溫度的敏感性減弱，而其中是否存在一定的抗凍性，還需要進一步研究。

4 結(jié)論

①從種公驢采集的總精液量、精子的凍后活力及復(fù)蘇率3方面考慮，最佳采精年齡為6歲；從精子密度方面分析，最佳采精年齡為5歲。②種公驢的采精年齡與總精液量、精子凍后活力及復(fù)蘇率之間均呈極顯著的正相關(guān)性（P＜0.01），與精子密度間存在顯著的負(fù)相關(guān)性（P＜0.05）。因此，合理安排種公驢的采精頻率，可以獲得穩(wěn)定的精液質(zhì)量。綜合以上各項指標(biāo)，建議用于人工繁殖的核心群公驢采精年齡以6～7歲為宜，以保證充足的精液量和較好的凍后活力。