殷濤 邵進(jìn) 張巖

[摘要] 目的 通過觀察機(jī)械敏感性離子通道蛋白Piezo1在人椎間盤髓核細(xì)胞中的表達(dá)情況，初步探討其在人椎間盤退變中的作用。 方法 收集2017年1月～2018年1月因腰椎退行性疾病在上海市浦東新區(qū)公利醫(yī)院行手術(shù)切除的椎間盤組織標(biāo)本作為實(shí)驗(yàn)對象，共收集26例（男15例，女11例），其中PfirrmannⅡ級3例，PfirrmannⅢ級8例，PfirrmannⅣ級15例，根據(jù)退變程度分組，將PfirrmannⅡ級的組織標(biāo)本作為對照組，PfirrmannⅢ、Ⅳ級作為退變組。通過HE染色觀察不同退變程度椎間盤的組織學(xué)變化，免疫組化檢測不同退變程度組織中機(jī)械敏感性離子通道蛋白Piezo1的定位及表達(dá)水平。 結(jié)果 HE染色結(jié)果顯示，隨著椎間盤退變程度增大，髓核細(xì)胞外基質(zhì)含量減少，髓核細(xì)胞數(shù)量減少，呈不同程度的退變或壞死。免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Piezo1在對照組和退變組髓核細(xì)胞中都有表達(dá)，主要在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)；對照組和退變組的陽性表達(dá)率分別為（45.43±13.14）%和（68.75±19.67）%，兩組的陽性表達(dá)率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。 結(jié)論 不同退變程度椎間盤的髓核細(xì)胞中有Piezo1表達(dá)的現(xiàn)象，且在退變組的Piezo1的表達(dá)水平較正常組升高，提示機(jī)械敏感性離子通道蛋白Piezo1可能參與了椎間盤中髓核細(xì)胞的退變過程。

[關(guān)鍵詞] 機(jī)械敏感性離子通道；Piezo1；髓核細(xì)胞；椎間盤退變

[中圖分類號] R681.5 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2019）04（c）-0077-04

Expression and significance of mechanically sensitive ion channel protein Piezo1 in nucleus pulposus cells of the intervertebral disc

YIN Tao1 SHAO Jin2 ZHANG Yan2 YANG Tieyi2

1.Graduate School of Ningxia Medical University， Ningxia Hui Autonomous Region， Yinchuan 750001， China；

2.Department of Orthopaedics， Gongli Hospital， Pudong New Area， Shanghai 200135， China

[Abstract] Objective To study the expression of Piezo1， a mechanically sensitive ion channel protein in human intervertebral disc nucleus cells， and to explore its role in human intervertebral disc degeneration. Methods A total of 26 specimens （15 males and 11 females） of intervertebral disc tissue surgically removed due to lumbar degenerative diseases were collected in the Shanghai Pudong New Area Gongli Hospital From January 2017 to January 2018. There were 3 cases of Pfirrmann Ⅱ， 8 cases of Pfirrmann Ⅲ， and 15 cases of Pfirrmann Ⅳ. According to the degree of degeneration， Pfirrmann Ⅱ tissue specimens were used as the control group， and Pfirrmann Ⅲ and Ⅳ were used as the degeneration group. HE staining was used to observe the histological changes of intervertebral discs with different degrees of degeneration. Immunohistochemistry staining was used to detect the localization and expression level of mechanically sensitive ion channel protein Piezo1 in tissues with different degrees of degeneration. Results The results of HE staining showed that with the increase of intervertebral disc degeneration， the extracellular matrix content of nucleus pulposus decreased， and the number of nucleus pulposus cells decreased， showing different degrees of degeneration or necrosis. The results of immunohistochemistry showed that Piezo1 was expressed in the nucleus pulposus cells of both the control group and the degenerative group， and the expression was mainly in the nucleus and cytoplasm； the positive expression rates of the control group and the degenerative group were （45.43±13.14）% and （68.75±19.67）%， there was a difference in the positive expression rate between the two groups （P < 0.05）. Conclusion Piezo1 expression was observed in nucleus pulposus cells of intervertebral disc with different degrees of degeneration， and the expression level of Piezo1 in the degenerative group was higher than that in the normal group， suggesting that Piezo1， a mechanically-sensitive ion channel protein， may be involved in the degenerative process of nucleus pulposus cells in intervertebral disc.

[Key words] Mechanically sensitive ion channels； Piezo1； Nucleus pulposus cells； Degeneration of intervertebral disc

研究[1]表明近80%的人在其一生中都經(jīng)歷過下腰痛（LBP）。腰部疼痛和坐骨神經(jīng)痛，對患者的生活質(zhì)量產(chǎn)生了嚴(yán)重的影響，造成了巨大的社會(huì)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[2]。在導(dǎo)致LBP的發(fā)病原因中，最常見的是椎間盤退變導(dǎo)致退行性椎間盤疾病和腰椎間盤突出癥（LDH）[3]。因此，充分了解LDH的發(fā)病機(jī)制、探討其治療方法具有重要意義。

年齡、遺傳、肥胖、外傷、生物力學(xué)等因素均會(huì)使腰椎間盤發(fā)生退變，進(jìn)而導(dǎo)致腰背痛、坐骨神經(jīng)痛等一系列癥狀[4]，而作為椎體間的連接裝置，椎間盤需承受壓縮、伸屈、扭轉(zhuǎn)等的力學(xué)負(fù)荷，異常應(yīng)力負(fù)荷強(qiáng)度的增加、頻率紊亂及負(fù)載過度都能導(dǎo)致椎間盤病理性改變和損害[5]，因此生物力學(xué)因素在LDH的發(fā)病中具有重要的影響。Piezo1機(jī)械敏感性離子通道蛋白是新發(fā)現(xiàn)的一種與細(xì)胞生物力學(xué)機(jī)械信號密切相關(guān)的、新型機(jī)械敏感性離子通道蛋白。目前關(guān)于Piezo1在與生物力學(xué)密切相關(guān)的椎間盤退變中的作用研究較少。本研究通過收集因腰椎疾病行椎間盤切除治療的患者的椎間盤組織標(biāo)本，對其進(jìn)行組織學(xué)檢查和免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)，初步探究Piezo1蛋白在椎間盤組織中定位表達(dá)的差異，及其與椎間盤退變的相關(guān)性，提供治療和減緩椎間盤退變的新的方法和思路。

1 材料與方法

1.1樣本采集

本研究選擇2017年1月～2018年1月因腰椎退行性疾病在上海市浦東新區(qū)公利醫(yī)院（以下簡稱“我院”）手術(shù)切除的椎間盤組織標(biāo)本作為實(shí)驗(yàn)對象，共收集26例。其中男15例，女11例；年齡：25～77歲，平均（52.3±12.6）歲；病變節(jié)段L3/4 4例，L4/5 13例，L5S1 9例；采用MRI上的T2加權(quán)像的Priffmann分級系統(tǒng)進(jìn)行椎間盤退變程度的分級評估，并排除患有腫瘤，感染，免疫和內(nèi)分泌疾病的患者。其中PfirrmannⅡ級3例，PfirrmannⅢ級8例，PfirrmannⅣ級15例，納入患者為腰椎盤源性腰痛、腰椎管狹窄、腰椎滑脫癥、LDH進(jìn)行椎間盤切除和/或腰椎后路椎體間融合術(shù)治療的患者。將PfirrmannⅡ級的組織標(biāo)本作為對照組，PfirrmannⅢ、Ⅳ級作為退變組。本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理審查委員會(huì)批準(zhǔn)并經(jīng)患者或家屬知情同意，簽署知情同意書。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 主要試劑、儀器 二甲苯（國藥集團(tuán)）EDTA（pH 8.0）抗原修復(fù)液（Boster）正常兔血清（Boster）蘇木素染液（Boster）一抗（Piezo1，1∶50））二抗（1∶2000，Boster）組化試劑盒DAB顯色劑（Boster）正置熒光顯微鏡及成像系統(tǒng)（Nikon Eclipse Ti-SR，日本尼康）病理切片機(jī)（RM2016，上海）顯微鏡（XSP-C204 CIC）組化筆（GT1 001Gene tech）。

1.2.2 組織學(xué)檢查（HE染色法） 將手術(shù)中獲得的患者的椎間盤組織的標(biāo)本，在30 min內(nèi)送到實(shí)驗(yàn)室，在無菌條件下對標(biāo)本進(jìn)行分離，將髓核組織用生理鹽水沖洗干凈，置于4%多聚甲醛固定48 h，石蠟包埋固定，切片機(jī)連續(xù)切片，制備5 μm厚度的石蠟切片，脫蠟水化，利用蘇木精-伊紅染色法（HE）染色，然后利用顯微成像系統(tǒng)拍照觀察對照組和退變組的椎間盤組織學(xué)特點(diǎn)。

1.2.3 免疫組化實(shí)驗(yàn) 采用免疫組化Elivison二步法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分析，具體如下：將石蠟切片脫蠟至水；進(jìn)行抗原修復(fù)；阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，再用BSA封閉；加入一抗（Piezo1，1∶50），4°C孵育過夜；加二抗，室溫孵育50 min；DAB顯色；復(fù)染細(xì)胞核；脫水封片。

最后顯微鏡鏡檢，圖像采集分析。統(tǒng)計(jì)計(jì)算Piezo1蛋白的陽性細(xì)胞表達(dá)率=5個(gè)視野內(nèi)陽性染色細(xì)胞總數(shù)/5個(gè)視野內(nèi)細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 24.0對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HE染色檢測結(jié)果

椎間盤組織的病理HE染色結(jié)果顯示，對照組：髓核細(xì)胞外基質(zhì)豐富，均質(zhì)淡染，膠原纖維排列略不規(guī)則，存在細(xì)微的破裂，髓核細(xì)胞呈軟骨樣細(xì)胞特點(diǎn)，胞膜完整，形態(tài)基本正常或少量異常，髓核細(xì)胞內(nèi)存在不規(guī)則的軟骨陷窩。退變組：髓核細(xì)胞外基質(zhì)含量明顯減少，膠原纖維增粗排列扭曲，排列紊亂，有大量裂隙產(chǎn)生，髓核細(xì)胞胞膜不完整，形態(tài)異常，細(xì)胞核消失，呈不同程度的退變或壞死。

2.2 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

對照組和退變組的髓核細(xì)胞中都可見到Piezo1蛋白呈棕黃色或棕褐色顆粒的陽性表達(dá)，主要定位在細(xì)胞內(nèi)，位于細(xì)胞核和靠近核膜的位置，在細(xì)胞外基質(zhì)中幾乎沒有表達(dá)；對照組髓核細(xì)胞呈類圓形或梭形，Piezo1蛋白免疫組化染色較淺，呈弱陽性。在退變組的髓核組織中，Piezo1蛋白免疫組化染色較深，呈強(qiáng)陽性（見圖2，封四）。對照組和退變組的陽性表達(dá)率分別為（45.43±13.14）%和（68.75±19.67）%，退變組椎間盤髓核細(xì)胞Piezo1蛋白陽性表達(dá)率高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t = 2.14，P = 0.026）。

3 討論

椎間盤是由中心的髓核、外側(cè)的纖維環(huán)及上下的軟骨終板組成，是一類特殊的軟骨組織。髓核是水合凝膠狀的結(jié)構(gòu)，其細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）富含蛋白多糖和Ⅱ型膠原，在正常椎間盤生理功能中發(fā)揮著重要作用[6]。研究[7]表明，正常生理椎間盤中，ECM的合成與代謝處于動(dòng)態(tài)平衡中，當(dāng)椎間盤發(fā)生退變時(shí)，髓核外基質(zhì)合成分解代謝紊亂，蛋白多糖和含水量降低、髓核組織纖維化，Ⅱ型膠原轉(zhuǎn)換為Ⅰ型膠原。引起椎間盤高度下降、組織韌性降低等一系列病理改變。而目前主要通過大體觀察法、組織病理學(xué)分級法和MRI分級法3種分類方法對椎間盤退變程度進(jìn)行描述[8]。其中MRI分級法中應(yīng)用較多的是Pfirrmann分級系統(tǒng)，根據(jù)MRI中T2加權(quán)像上髓核信號強(qiáng)度、纖維環(huán)信號強(qiáng)度、髓核與纖維環(huán)界限、椎間盤高度等因素，將椎間盤退變分為Ⅰ～Ⅴ級[9]。本研究根據(jù)Pfirrmann分級法對椎間盤退變程度進(jìn)行分級評估，共分為兩組，Ⅱ級可認(rèn)為是對照組，Ⅲ級和Ⅳ級劃分至退變組，HE染色結(jié)果表明：組織標(biāo)本的HE病理結(jié)果與Pfirrmann分級評估的判定一致。且隨著椎間盤退變程度的增大，髓核細(xì)胞外基質(zhì)含量明顯減少，髓核細(xì)胞數(shù)量減少，膠原纖維增粗排列扭曲、紊亂，有大量裂隙產(chǎn)生，髓核細(xì)胞形態(tài)異常，呈不同程度的退變或壞死。

椎間盤作為上下椎體間的連接部分，在承受身體重量，緩沖壓力負(fù)荷中發(fā)揮著重要作用[10]。在對椎間盤退變機(jī)制的研究中，生物力學(xué)因素對脊柱的生物代謝活動(dòng)有著重要的影響。Lotz等[11]研究表明壓力的大小、持續(xù)時(shí)間與椎間盤細(xì)胞凋亡率呈正相關(guān)，是導(dǎo)致腰椎間盤退變、突出的重要因素。因此對于椎間盤髓核細(xì)胞生物力學(xué)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制的研究成為椎間盤退變機(jī)制的研究熱點(diǎn)。

機(jī)械敏感性離子通道是一類可以感受細(xì)胞膜機(jī)械應(yīng)力的變化并迅速作出反應(yīng)的離子通道，離子通道的這種反應(yīng)可以將膜感受到的機(jī)械信號轉(zhuǎn)化為電信號或化學(xué)信號，從而調(diào)控細(xì)胞的生命活動(dòng)[12]。Piezo機(jī)械離子通道是2010年Coste等[13]發(fā)現(xiàn)的一種新型機(jī)械敏感性離子通道，是與生物力學(xué)機(jī)械信號密切相關(guān)的一種離子通路蛋白。脊椎動(dòng)物存在兩種類型的Piezo通道蛋白，即Piezo1和Piezo2蛋白，它們分別由FAM38A和FAM38B基因編碼，由2500和2800個(gè)氨基酸構(gòu)成。Piezo1蛋白是擁有24～40個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域的巨大跨膜蛋白，Piezo1蛋白在與機(jī)械敏感相關(guān)的各種細(xì)胞類型和器官中廣泛表達(dá)。例如胃竇G細(xì)胞、皮膚、膀胱、腎臟、肺臟、內(nèi)皮細(xì)胞、紅細(xì)胞和牙根膜韌帶細(xì)胞等真核細(xì)胞[14-16]。但目前在退變髓核組織中是否存在Piezo1蛋白的表達(dá)以及在腰椎退變疾病中的作用的相關(guān)報(bào)道較少。本研究通過免疫組化染色分析Piezo1蛋白在不同退變程度的椎間盤組織中的定位表達(dá)情況。結(jié)果表明，對照組和退變組中都存在Piezo1蛋白的表達(dá)現(xiàn)象，Piezo1蛋白主要定位在細(xì)胞內(nèi)，位于細(xì)胞核和靠近核膜的位置都可見棕黃色或深棕褐色顆粒的陽性表達(dá)。

目前對于Piezo1蛋白功能的研究中，Piezo1在紅細(xì)胞中的突變與人類貧血和血細(xì)胞增多癥密切相關(guān)[17]。在膀胱中，在尿路上皮細(xì)胞中檢測到piezo1蛋白在機(jī)械拉伸刺激下促進(jìn)ATP釋放，因此其可能參與膀胱延伸的感知[18]。最近的一項(xiàng)研究[19-20]表明，在小鼠的發(fā)育中敲除Piezo1基因使血管重塑存在缺陷，導(dǎo)致胚胎致死。由此可見，Piezo1蛋白在生物的生命活動(dòng)中具有重要作用。另外有學(xué)者研究[21-22]表明，在軟骨細(xì)胞中，Piezo1蛋白與軟骨細(xì)胞的異常凋亡過程相關(guān)，而軟骨細(xì)胞與椎間盤細(xì)胞是同源性細(xì)胞，且椎間盤中的髓核細(xì)胞的生命活動(dòng)與生物力學(xué)密切相關(guān)。本研究首次分析Piezo1蛋白在不同退變程度的椎間盤組織中的表達(dá)差異，雖然退變組的椎間盤組織中的髓核細(xì)胞的數(shù)量較對照組減少，但退變組的髓核細(xì)胞中Piezo1蛋白的陽性表達(dá)率[（68.75±19.67）%]明顯高于對照組[（45.43±13.14）%]，提示Piezo1蛋白在腰椎間盤退變過程中可能發(fā)揮重要的調(diào)控作用。由于髓核細(xì)胞在生物學(xué)上是一種類軟骨細(xì)胞，兩者具有相似的細(xì)胞生物學(xué)特性[23]。因此，我們推測Piezo1蛋白可能參與髓核細(xì)胞的異常凋亡生命活動(dòng)的調(diào)控。

本研究通過收集不同患者的椎間盤手術(shù)標(biāo)本，將MRI檢查與組織學(xué)結(jié)合，對患者椎間盤退變程度進(jìn)行評價(jià)分析；然后通過免疫組織化學(xué)的方法比較對照組和退變組髓核細(xì)胞中Piezo1蛋白的表達(dá)及定位特點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)Piezo1在兩組髓核細(xì)胞中都有表達(dá)，且其表達(dá)水平與退變程度存在一定的相關(guān)性。提示Piezo1蛋白表達(dá)的增加可能會(huì)加速椎間盤的退變，但本研究還需要更進(jìn)一步的細(xì)胞、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究來驗(yàn)證兩者間的因果關(guān)系。

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（收稿日期：2018-11-01 本文編輯：封 華）