胡 旭，邢寶春

(河南省胸科醫(yī)院內(nèi)五科，鄭州 450000)

據(jù)WHO統(tǒng)計，結(jié)核(tuberculosis,TB)是全球人口十大死因之一，肺外結(jié)核(extrapulmonary TB,EPTB)占全部結(jié)核的15%，且發(fā)病率不斷增加[1]。結(jié)核性心包炎是EPTB的一種，是引起發(fā)展中國家人口心包積液和縮窄性心包炎的最常見病因，病死率高達17%～40%，因此早期診斷和治療十分重要[2]。心包積液中含菌量少，細菌培養(yǎng)和微生物學(xué)檢驗的靈敏度低，結(jié)核性心包炎的診斷仍然面臨挑戰(zhàn)[3]。早期開始抗TB治療可以降低結(jié)核性心包炎的病死率，因此，臨床快速準(zhǔn)確地診斷十分重要。

GeneXpert MTB/RIF是一種全自動半巢式實時聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)系統(tǒng)，可以在3 h內(nèi)快速診斷TB和利福平(RIF)耐藥[4]。2010年WHO開始推薦使用Xpert MTB/RIF方法，并在2013年更新了官方指導(dǎo)：Xpert MTB/RIF試驗或許可以代替采用非呼吸標(biāo)本診斷肺外結(jié)核的常用方法(傳統(tǒng)鏡檢、細菌培養(yǎng)或組織病理學(xué)檢查)。許多研究將Xpert應(yīng)用于EPTB，如淋巴結(jié)結(jié)核[5]、泌尿系結(jié)核[6]、結(jié)核性胸膜炎[7]和結(jié)核性腦膜炎[8]，并取得了較好的診斷效能。Xpert在結(jié)核性心包炎的診斷價值研究極少，國內(nèi)尚無將Xpert應(yīng)用于結(jié)核性心包炎的研究。本研究將評價GeneXpert MTB/RIF在結(jié)核性心包炎診斷及RIF耐藥檢測中的應(yīng)用價值。

1 資料與方法

1.1一般資料 連續(xù)收集2015年8月至2017年2月在河南省胸科醫(yī)院住院治療的疑似結(jié)核性心包炎患者資料。入組標(biāo)準(zhǔn)：大量心包積液(在舒張期超聲檢查心臟周邊無回聲區(qū)大于10 mm)；年齡大于18周歲；簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：懷孕；心包穿刺前抗結(jié)核治療超過1周；拒絕簽署知情同意書或無行為能力。最終190例患者入組，且研究獲得本院倫理委員會審核通過。

1.2標(biāo)本獲取及處理 患者心包穿刺或心包活檢由臨床醫(yī)師操作，至少獲取50 mL心包積液。所獲得的心包積液標(biāo)本及心包活檢標(biāo)本送本院檢驗科。心包積液行常規(guī)生化分析、涂片染色鏡檢、BACTEC MGIT 960系統(tǒng)液體培養(yǎng)和GeneXpert MTB/RIF檢測。挑選培養(yǎng)陽性的菌株進行藥敏試驗和菌株鑒定。標(biāo)本-20 ℃儲存。

1.3涂片鏡檢 按標(biāo)準(zhǔn)操作[9]，吸取0.05～0.1 mL標(biāo)本，涂抹10 mm×20 mm大小，每份標(biāo)本涂抹2張涂片，抗酸染色后使用熒光顯微鏡鏡檢抗酸桿菌。

1.4細菌培養(yǎng) 采用NaOH-乙酰半胱氨酸法進行去污染處理。液體培養(yǎng)按照MGIT 960系統(tǒng)操作說明書進行。出現(xiàn)陽性結(jié)果后，取培養(yǎng)液涂片使用快速抗酸染色進行確認(rèn)，染色陽性菌株使用傳統(tǒng)培養(yǎng)法鑒定桿菌類型。

1.5藥敏試驗 按BACTEC MGIT960系統(tǒng)中利福平藥敏試驗操作說明進行。藥物作用濃度為1 mg/L，該方法作為藥敏試驗結(jié)果的參考。

表1 入組患者基線資料

1.6菌型鑒定 按標(biāo)準(zhǔn)操作[10]，取陽性菌株培養(yǎng)液0.1 mL分別接種于含PNB和TCH的羅氏培養(yǎng)管中，36 ℃培養(yǎng)4周，TCH陽性、PNB陰性為結(jié)核分枝桿菌(mycobacterium tuberculosis,MTB)，TCH陽性、PNB陽性為非結(jié)核分枝桿菌(nontuberculosis mycobacteria,NTM)。

1.7GeneXpert MTB/RIF 按WHO官方應(yīng)用指南中的肺外標(biāo)本標(biāo)準(zhǔn)處理流程進行。將10 mL心包積液標(biāo)本離心(3 000 r/min,15 min)，移除上清液，加入Xpert樣本試劑充分懸浮沉淀至2 mL，后移入Xpert反應(yīng)盒中，按照廠家說明裝載入儀器中。自動化檢測結(jié)束后在檢測系統(tǒng)可觀察測試結(jié)果，不確定的結(jié)果不進入數(shù)據(jù)分析。

1.8診斷分組 通過細菌培養(yǎng)結(jié)果、心包活檢病理結(jié)果、心包積液常規(guī)生化分析結(jié)果、抗結(jié)核治療效果進行診斷分類。TB確診：固體或液體細菌培養(yǎng)陽性(心包積液標(biāo)本或非心包積液標(biāo)本)和(或)心包組織病理為肉芽腫性炎癥。臨床TB：不滿足TB確診標(biāo)準(zhǔn)，但臨床表現(xiàn)高度可疑(癥狀、影像學(xué)、心包積液常規(guī)生化分析)，抗結(jié)核治療有效。TB確診和臨床TB為TB組。非TB組：無TB微生物學(xué)證據(jù)，診斷為其他疾病。

表2 Xpert、涂片鏡檢和細菌培養(yǎng)在結(jié)核性心包炎中的診斷結(jié)果(%)

2 結(jié) 果

2.1患者入組情況和基線資料 190例患者連續(xù)入組，排除10例患者，其中5例培養(yǎng)污染(2.6%)，2例為非結(jié)核分枝桿菌感染(1.1%)，3例Xpert結(jié)果不確定(1.6%)。最后納入結(jié)果分析共180例，其中14例為TB確診(7.8%)，38例為臨床TB(21.1%)，TB組共52例(28.9%)，非TB組共128例(71.1%)，患者基線資料見表1。

2.2Xpert診斷結(jié)果 將細菌培養(yǎng)作為金標(biāo)準(zhǔn)，Xpert的靈敏度為78.6%，特異度為85.5%，PPV為31.4%，NPV為97.9%。只有1例TB確診的患者心包積液涂片鏡檢陽性，涂片鏡檢靈敏度為7.1%，低于Xpert(χ2=14.583,P<0.01)，特異度為100.0%，高于Xpert(χ2=25.870,P<0.01)。臨床TB結(jié)果聯(lián)合細菌培養(yǎng)作為金標(biāo)準(zhǔn)(復(fù)合參考標(biāo)準(zhǔn))，Xpert的靈敏度為65.4%，特異度為99.2%，PPV為97.1%，NPV為87.6%。細菌培養(yǎng)靈敏度為26.9%，特異度為100.0%。細菌培養(yǎng)的靈敏度低于Xpert，(χ2= 15.467,P<0.01)，特異度與Xpert比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=1.004,P=0.316)。涂片鏡檢靈敏度為2.0%，低于Xpert(χ2=46.897,P<0.01)及細菌培養(yǎng)(χ2= 13.166,P<0.01)，特異度為100.0%，與Xpert比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=1.004,P=0.316)。在TB確診患者，Xpert共檢測出6例RIF耐藥患者，其中5例與藥敏試驗一致，靈敏度為100.0%;另1例Xpert檢驗RIF耐藥，藥敏試驗顯示敏感，后經(jīng)臨床用藥證實為RIF耐藥。在臨床TB患者，Xpert共檢測出15例RIF耐藥患者，復(fù)合標(biāo)準(zhǔn)下RIF耐藥率為40.4%(21/52)，見表2。

3 討 論

WHO認(rèn)為Xpert MTB/RIF試驗或許可以代替采用非呼吸標(biāo)本診斷肺外結(jié)核的常用方法，并已推薦作為可疑結(jié)核性腦膜炎患者腦脊液的首選檢查。在RIF耐藥檢測方面，WHO認(rèn)為陰性的Xpert MTB/RIF結(jié)果可以排除RIF耐藥，且無需進一步試驗證實。在我國，高感染率、高患病率和高耐藥率，認(rèn)知率、發(fā)現(xiàn)率和服藥依從性差，患病率下降緩慢等構(gòu)成結(jié)核病的流行特點[11]，因此在國內(nèi)積極開展GeneXpert MTB/RIF檢測應(yīng)用及研究十分必要。本研究表明Xpert在心包積液標(biāo)本中的表現(xiàn)優(yōu)于涂片鏡檢和液體細菌培養(yǎng)。

本研究中，28.9%(52/180)的心包積液患者診斷為結(jié)核性心包炎。BIAN 等[12]發(fā)現(xiàn)在75例可疑結(jié)核性心包炎患者中，24例(32%)患者診斷為結(jié)核，MA 等[13]發(fā)現(xiàn)在140例中國漢族中等及大量心包積液的患者中，40例(28.6%)為結(jié)核性，與本研究結(jié)果一致。

Xpert MTB/RIF診斷肺外結(jié)核病的靈敏度報道不一，從25%到96.6%不等，但大多都超過50%。肺外標(biāo)本多樣、含菌量低且獲取困難，同時標(biāo)本預(yù)處理不同以及參考金標(biāo)準(zhǔn)的不一致，導(dǎo)致了Xpert用于肺外結(jié)核病的研究比較復(fù)雜。BAHR等[14]發(fā)現(xiàn)使用較大的腦脊液量離心后Xpert靈敏度為72%，接近培養(yǎng)法的71%，而使用2 mL未離心的腦脊液則只有28%的靈敏度。本研究采用10 mL心包積液標(biāo)本進行離心濃縮處理，取得了較好診斷準(zhǔn)確度，且Xpert不確定結(jié)果數(shù)量較少(3/190,1.6%)。有研究將心包積液標(biāo)本(20 mL)離心處理后并未有效地增加診斷準(zhǔn)確度，反而增加了不確定結(jié)果的數(shù)量(10.4%)。筆者認(rèn)為可能是由于較大量的心包積液離心形成了較多的血細胞團塊以及滲出炎癥蛋白，從而造成PCR反應(yīng)失敗。因此10 mL的標(biāo)本量或許值得推薦，BAHR等[15]同樣推薦8～10 mL腦脊液并進行離心處理用于Xpert，但最佳的標(biāo)本量仍需進一步研究。

本研究中，以細菌培養(yǎng)作為金標(biāo)準(zhǔn)，Xpert的靈敏度為78.6%，特異度為85.5%。SAEED等[16]研究發(fā)現(xiàn)，在細菌培養(yǎng)作為金標(biāo)準(zhǔn)時，心包積液的Xpert靈敏度為72.2%，與本研究相似。由于肺外標(biāo)本含菌量低，培養(yǎng)不是最佳的金標(biāo)準(zhǔn)。本研究聯(lián)合了細菌培養(yǎng)和臨床診斷TB作為復(fù)合參考標(biāo)準(zhǔn)進一步評價Xpert的診斷效能，因此結(jié)果可能會更加精確。以復(fù)合參考標(biāo)準(zhǔn)為金標(biāo)準(zhǔn)，Xpert診斷靈敏度為65.4%，高于細菌培養(yǎng)和涂片鏡檢。

本研究中Xpert在心包積液的診斷效能優(yōu)于其他研究。本研究取得較高的診斷效能可能源于較少的病例數(shù)、合適的標(biāo)本量(10 mL)及未進行去污染處理，一定程度上避免了菌量的丟失及血細胞和炎性蛋白的干擾。VADWAI 等[17]分析了3例心包積液Xpert結(jié)果，取得了100%的靈敏度，因而存在較大偏差。血性或者黃色腦脊液標(biāo)本可能會導(dǎo)致Xpert的假陰性結(jié)果，而本研究患者有較高比例的血性或黃色渾濁心包積液，可能影響了Xpert的診斷效能，研究消化炎性蛋白的方法或者加入合適的血細胞裂解液或許可以進一步提升Xpert的診斷效能[18]。由于Xpert在結(jié)核性心包炎診斷中的應(yīng)用研究報道極少，本研究的診斷效能不一定普遍適用。

相對于復(fù)合參考標(biāo)準(zhǔn)，本研究細菌培養(yǎng)的靈敏度較低(26.9%)，可能下列原因有關(guān)：部分患者入組前接受了幾日的抗結(jié)核治療；肺外標(biāo)本含菌量低的特性使得結(jié)核分枝桿菌傾向于形成菌團，培養(yǎng)時而無法均勻分布影響生長效能；NaOH-乙酰半胱氨酸法去污染處理的過程中會造成菌量的丟失。

本研究顯示河南地區(qū)TB耐藥率為40.4%，與國內(nèi)研究一致[19]。Xpert在RIF耐藥檢測方面靈敏度為100%，與普遍研究均一致。其中1例Xpert顯示RIF耐藥而藥敏試驗為敏感。在WHO指南中同樣指出Xpert試驗顯示部分耐RIF的結(jié)核菌株在藥敏試驗和耐藥表型檢測中為敏感，但通過DNA測序后通常都支持Xpert結(jié)果。本研究中該患者經(jīng)臨床一線藥物診治證實為耐藥，符合Xpert結(jié)果。

本研究發(fā)現(xiàn)GeneXpert MTB/RIF在結(jié)核性心包炎中取得了相對較好的診斷效能，但有研究發(fā)現(xiàn)Xpert的靈敏度低于其他方法，如T-SPOT、TB、IGRAs等。結(jié)核需要快速精確的診斷，聯(lián)合GeneXpert MTB/RIF與其他診斷方法，進一步尋求最佳的診斷效能或許是下一步研究的方向。