朱 林 王厚鵬 朱作言 孫永華 葉 鼎

(1. 中國科學(xué)院水生生物研究所淡水生態(tài)與生物技術(shù)國家重點實驗室，武漢 430072;2. 中國科學(xué)院大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué)學(xué)院，武漢 430072)

Nanos通常被認(rèn)為對生殖細(xì)胞的存活和全能性的維持起重要作用。動物中一般存在1—4個nanos基因[1]。該基因編碼高度保守的RNA結(jié)合蛋白。該蛋白C端擁有2個連續(xù)的半胱氨酸-半胱氨酸-組氨酸-半胱氨酸(Cys-Cys-His-Cys, CCHC)鋅指基序[2,3]。

Nanos基因在非脊椎動物和脊椎動物中均得到了鑒定和研究。果蠅(Drosophila melanogaster)中只有1個nanos基因, 該基因在介導(dǎo)腹部形成、原始生殖細(xì)胞(Primordial Germ Cells, PGCs)特化和遷移以及生殖干細(xì)胞的維持等方面發(fā)揮重要作用[4,5]。在小鼠(Mus musculus)中,nanos2和nanos3在PGCs和未分化的精原細(xì)胞中表達(dá),nanos2突變導(dǎo)致雄性精原細(xì)胞的缺失, 而nanos3突變導(dǎo)致精巢和卵巢中的生殖細(xì)胞均缺失[6]。在硬骨魚類中, 斑馬魚(Danio rerio)nanos有3個基因:nanos1、nanos2、nanos3。Nanos1在成熟卵巢的早期卵母細(xì)胞中有表達(dá);nanos2在成魚精卵巢的生殖干細(xì)胞中表達(dá), 對于維持生殖干細(xì)胞必不可少[7,8];nanos3在生殖質(zhì)和PGCs中特異性表達(dá)[9], 對PGCs的形成和遷移以及卵母細(xì)胞的產(chǎn)生及維持至關(guān)重要[7,9]。

在魚類中,nanos3的3′UTR常被用于介導(dǎo)熒光蛋白在PGCs中特異性表達(dá), 用于PGCs的活體標(biāo)記[10]。利用胚胎注射EGFP-nanos3′UTR mRNA的方法, 在斑馬魚[10]、鯉(Cyprinus carpio)[11]、青鳉(Oryzias latipe)[12]、日本鰻鱺(Anguilla japonica)[13]、牙鲆(Paralichthys olivaceus)[14]中實現(xiàn)了PGCs的可視化標(biāo)記。

團頭魴(Megalobrama amblycephala)屬鯉形目,鯉科, 魴屬, 又名武昌魚。其具有養(yǎng)殖成本低、生長迅速、食性廣、養(yǎng)殖成活率高、肉質(zhì)鮮美等特點, 是我國重要的經(jīng)濟魚類之一[15]。為了開展團頭魴原始生殖細(xì)胞操作相關(guān)的研究, 我們克隆和分析了團頭魴的nanos3基因, 并利用該基因的3′UTR序列進(jìn)行特異性標(biāo)記PGCs實驗。我們發(fā)現(xiàn), 和斑馬魚nanos3的3′UTR相比, 利用團頭魴自身的nanos3-3′UTR能夠更加特異地標(biāo)記團頭魴的PGCs。這項研究工作為將來開展基于團頭魴PGCs的遺傳操作提供便利。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本研究所用雌、雄團頭魴均養(yǎng)殖于中國科學(xué)院水生生物研究所官橋水產(chǎn)養(yǎng)殖基地, 在繁殖季節(jié)采用人工授精的方法獲取團頭魴的胚胎, 置于(22±1)℃的環(huán)境發(fā)育。成體組織取自2齡的團頭魴。AB品系的斑馬魚均來自于國家斑馬魚資源中心(武漢, http://zfish.cn)。斑馬魚飼養(yǎng)于14h∶10h光暗周期及28.5℃恒溫條件下。用于顯微注射的胚胎由雌、雄斑馬魚自然產(chǎn)卵而得。

1.2 方法

總RNA的提取獲取團頭魴不同發(fā)育時期胚胎及幼魚和成體不同組織, 采用Trizol (Invitrogen)法提取胚胎、幼魚及成魚各組織的總RNA, 用超微量分光光度計(Thermo, NanoDrop 2000)和1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的濃度及純度, 將RNA溶于無核酸酶水中, 置于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

團頭魴nanos3基因全長cDNA的克隆根據(jù)斑馬魚和鯉魚nanos3基因的序列比對, 在保守功能域設(shè)計引物nanos-F和nanos-R (表1)。以團頭魴卵巢組織總RNA為模板, 根據(jù)Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Fisher Scientific)說明書反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。以此cDNA為模板進(jìn)行PCR擴增, 獲得團頭魴nanos3基因的中間片段。根據(jù)獲得的中間片段, 設(shè)計RACE(Rapid-amplification of cDNA ends)擴增引物(表1)。3′RACE和5′RACE利用System for Rapid Amplification of cDNA Ends試劑盒(Thermo Fisher Scientific)并按照說明書進(jìn)行。

擴增的PCR產(chǎn)物經(jīng)DNA純化試劑盒(Thermo Fisher Scientific)純化回收DNA后連接至pMD18-T(TaKaRa), 經(jīng)轉(zhuǎn)化、挑克隆和測序(武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司), 獲得相應(yīng)片段的陽性克隆。所獲得的片段序列經(jīng)Lasergene軟件拼接分析獲得團頭魴nanos3基因全長cDNA序列。

表1 團頭魴nanos3基因cDNA全長的克隆及表達(dá)所用到的引物Tab. 1 Primers used for nanos3 full length cDNA cloning and expression

nanos3基因氨基酸序列比對及系統(tǒng)進(jìn)化分析使用Lasergene軟件預(yù)測團頭魴nanos3基因編碼的氨基酸序列, 采用BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)和Clustal W (https://www.genome.jp/tools-bin/clustalw)將預(yù)測的氨基酸序列與NCBI的其他物種Nanos3進(jìn)行蛋白質(zhì)序列比對。同時, 基于各個物種Nanos3蛋白序列, 使用MEGA5.1軟件構(gòu)建NJ (Neighbor-joining方法)系統(tǒng)發(fā)育樹[16]。所用到各物種的氨基酸序列GenBank登錄號如下: 團頭魴(M. amblycephala): MH215557; 金線鲃(Sinocyclocheilus grahami): XP_016139847; 鯉(C. carpio): XP_018955255;銀鯽(Carassius gibelio): AKP99418; 斑馬魚(D. rerio):NP_571953; 大西洋鮭(Salmo salar); XP_013985774;虹鱒(Oncorhynchus mykiss): NP_001268351; 青鳉(O. latipes): NP_001116380; 羅非魚(Oreochromis niloticus): XP_005467279; 人(Homo sapiens):NP_001092092; 小鼠(Mus musculus): NP_918948;果蠅(Drosophila melanogaster): NP_476658; 爪蟾(Xenopus laevis): XP_018107247。

團頭魴nanos3 mRNA在不同發(fā)育時期和成體組織中的表達(dá)分析根據(jù)已獲得的團頭魴nanos3基因序列, 設(shè)計半定量及定量引物(表1)。以β-actin作為內(nèi)參, 采用半定量(定量)方法檢測團頭魴nanos3基因mRNA在不同發(fā)育時期及成魚不同組織中的表達(dá)情況。

pCS2-SP6∶EGFP-mananos3-3′UTR 質(zhì)粒的構(gòu)建、mRNA合成及顯微注射實驗以團頭魴卵巢cDNA為模板, 以XhoⅠ-mananos3UTR-S和XbaⅠ-mananos3UTR-A為引物(表1)進(jìn)行PCR擴增。其產(chǎn)物經(jīng)雙酶切后插入到pCS2+的載體上得到pCS2-SP6∶EGFP-mananos3-3′UTR質(zhì)粒。質(zhì)粒pCS2-SP6∶EGFP-zfnanos3-3′UTR和pCS2-SP6∶EGFP-mananos3-3′UTR, 分別使用NotⅠ和XbaⅠ線性化后, 通過mMessage mMachine sp6 UltraKit(Thermo Fisher Scientific)體外轉(zhuǎn)錄試劑盒合成和純化mRNA。合成的mRNA用超微量分光光度計測濃度和純度, 用瓊脂糖凝膠電泳檢測mRNA的質(zhì)量。將合成的mRNA分別注射進(jìn)入1細(xì)胞期團頭魴和斑馬魚的胚胎中, 在斑馬魚發(fā)育至1 dpf和團頭魴發(fā)育至2 dpf時, 于熒光顯微鏡下觀察各自PGCs被標(biāo)記效率并作統(tǒng)計。

mananos3-3′UTR 點突變質(zhì)粒的構(gòu)建及顯微注射實驗利用BioEdit7.0和Clustal W將團頭魴和斑馬魚的3′UTR進(jìn)行序列比對, 比對后分別設(shè)計突變引物mananos-mut1-F/mananos-mut2-F與mananos-mut-R, 并利用反向PCR構(gòu)建pCS2-SP6∶EGFP-mananos3-3′UTR_mut1和pCS2-SP6∶EGFP-mananos3-3′UTR_mut2突變質(zhì)粒。質(zhì)粒經(jīng)XbaⅠ線性化后用mMessage mMachine sp6 UltraKit (Thermo Fisher Scientific)體外轉(zhuǎn)錄試劑盒合成然后純化mRNA, 注射1細(xì)胞期的斑馬魚胚胎, 在斑馬魚發(fā)育至1 dpf時, 觀察胚胎熒光情況并作統(tǒng)計。

2 結(jié)果

2.1 團頭魴nanos3基因全長cDNA的克隆及序列分析

本研究利用RT-PCR和RACE方法成功獲得團頭魴的nanos3基因全長 cDNA序列(GenBank登錄號MH215557), 其全長為1027 bp, 包括48 bp的 5′非編碼區(qū)(5′UTR), 490 bp的3′非編碼區(qū)(3′UTR)和489 bp的開放閱讀框(ORF)。該基因編碼162個氨基酸。氨基酸序列比對結(jié)果顯示, 團頭魴Nanos3蛋白同其他物種的Nanos3蛋白具有較高的相似性, 與鯉科魚類中的金線鲃(S. grahami)、鯉(C. carpio)、銀鯽(C. gibelio)和斑馬魚(D. rerio)相似性較高, 依次為77.2%、77.1%、75.9%和69.2%; 同鮭科魚類[大西洋鮭魚(S. salar)和虹鱒(O. mykiss)]和哺乳類[人類(H. sapiens)和小鼠(M. musculus)]的相似性較低, 在34%—48.1%(圖1A)。但是, 它們均擁有1個保守的RNA結(jié)合功能域。在該功能域里面包含一個鋅指基序“CCHC CCHC”?；诘鞍踪|(zhì)序列, 利用MEGA5.1軟件構(gòu)建NJ系統(tǒng)發(fā)育樹(圖1B), 結(jié)果顯示團頭魴的Nanos3蛋白同鯉魚和斑馬魚的Nanos3聚為一支。這表明團頭魴的Nanos3與鯉魚和斑馬魚的Nanos3最為相近。

2.2 團頭魴nanos3 mRNA在不同發(fā)育時期和成體組織中的表達(dá)分析

我們利用半定量和熒光定量PCR方法檢測了團頭魴不同發(fā)育時期胚胎以及成魚不同組織中nanos3 mRNA表達(dá)水平。我們發(fā)現(xiàn)團頭魴的nanos3具有母源表達(dá), 在胚胎發(fā)育早期(shield時期以前)均具有較高的表達(dá)。在bud時期之后,nanos3 mRNA的表達(dá)量逐漸減少。從受精后3—15d, 在幼魚中很難檢測到nanos3的表達(dá) (圖2A)。nanos3在團頭魴胚胎發(fā)育各時期的表達(dá)特征同該基因在其他魚類胚胎發(fā)育中的表達(dá)特征相似[17—19], 這暗示了nanos3在魚類中可能具有相對保守的表達(dá)調(diào)控機制。在成魚各組織中,nanos3 mRNA在卵巢中高表達(dá), 在肝、腎、肌肉、心臟、腮、腦、腸、脾和精巢等組織中不表達(dá)(圖2B)。以上結(jié)果表明, 團頭魴nanos3不僅是一個母源基因, 還是一個卵巢特異高量表達(dá)基因。

圖1 團頭魴Nanos3氨基酸序列比對及系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig. 1 The Alignment of predicted amino acid sequence of Megalobrama amblycephala Nanos3 with its homologs in selected vertebrates(A) and Neighbor-Joining phylogenetic tree (NJ tree) of Nanos3 homologs of selected vertebrates (B)

2.3 團頭魴nanos3-3′UTR能夠穩(wěn)定EGFP在PGCs中的表達(dá)

接下來, 我們分別在團頭魴和模式動物斑馬魚中研究了mananos3-3′UTR介導(dǎo)綠色熒光蛋白(EGFP)特異性標(biāo)記PGCs的功能。我們將EGFP-mananos3-3′UTR mRNA或者EGFP-zfnanos3-3′UTR mRNA分別注射進(jìn)入斑馬魚和團頭魴1細(xì)胞期受精卵, 并統(tǒng)計了非PGCs組織具有較強熒光(High background)和較弱熒光(Low background)的胚胎數(shù)。我們發(fā)現(xiàn)所有注射有以上任意一種mRNA的胚胎均能夠標(biāo)記PGCs, 其區(qū)別主要在于背景熒光強度上, 即nanos3-3′UTR介導(dǎo)mRNA在非PGCs組織中的降解效率(圖3C、3D)。在注射有EGFP-zfnanos3-3′UTR mRNA的斑馬魚胚胎中, 絕大多數(shù)胚胎(98%,n=100)具有較弱的熒光背景; 而同樣的mRNA注射進(jìn)入團頭魴胚胎中, 大多數(shù)胚胎(96.4%,n=83)的熒光背景較強(圖3C、3E)。在注射有EGFP-mananos3-3′UTR mRNA的團頭魴胚胎中, 有86.7%的胚胎(n=60)具有較弱的熒光背景, 而同樣的mRNA注射進(jìn)入斑馬魚胚胎中, 83.3%的胚胎(n=90)卻具有較強的熒光背景(圖3D、3F)。這些數(shù)據(jù)表明, 物種本身的nanos3-3′UTR能夠更加特異地標(biāo)記自身的PGCs。總之,mananos3-3′UTR具有同其他硬骨魚類nanos3-3′UTR相似的功能, 除可以有效標(biāo)記團頭魴的PGCs外, 也可以標(biāo)記斑馬魚的PGCs。

圖2 團頭魴nanos3在胚胎發(fā)育不同時期和成體不同組織表達(dá)譜Fig. 2 The expression level of mananos3 during embryogenesis and among different adult tissues

2.4 團頭魴nanos3-3′UTR表達(dá)調(diào)控區(qū)域的鑒定

在斑馬魚中, miR430通過結(jié)合nanos3-3′UTR序列介導(dǎo)mRNA在體壁細(xì)胞中的降解[20,21]。經(jīng)典的miR430識別位點為GCACUU[22]。通過比對團頭魴和斑馬魚nanos3-3′UTR序列, 我們發(fā)現(xiàn)在團頭魴nanos3-3′UTR的173—178 nt位置具有一個潛在的miR430識別位點GCACUA (WT, “_”標(biāo)識出了與經(jīng)典miR430識別位點不同的堿基)(圖4A、4B)。我們通過設(shè)計引物(表1), 將mananos3-3′UTR的該位點分別突變?yōu)閙iR430經(jīng)典的識別位點GCACUU(mut1)和不能識別的位點CUACUA (mut2, “_”指出了與經(jīng)典miR430識別位點不同的堿基)(圖4B), 并以斑馬魚為模式動物進(jìn)一步探究該位點是否有利于EGFP在非PGCs細(xì)胞中有效降解從而使PGCs能夠被EGFP更特異的標(biāo)記。通過觀察1dpf的胚胎,我們發(fā)現(xiàn)在注射有EGFP-mananos3-3′UTR WT的群體中, 具有高背景的胚胎占比73%(n=100); 在注射有EGFP-mananos3-3′UTR mut1 (突變位點理論上能夠被miR430更好地識別)的群體中, 具有高背景的胚胎得到明顯減少(40%,n=90); 而在注射有EGFP-mananos3-3′UTR mut2 (突變位點理論上不能被miR430識別)的群體中, 具有高背景的胚胎進(jìn)一步增多(87%,n=120)(圖4C)。該數(shù)據(jù)表明團頭魴nanos3-3′UTR中的序列“GCACUA”可能是miR430識別的位點。

圖4 團頭魴nanos3-3′UTR miR430結(jié)合位點的鑒定Fig. 4 Identification of miR430 binding motif in mananos3-3′UTR

3 討論

本研究首次克隆了團頭魴的nanos3 全長cDNA(mananos3, GenBank: MH215557)。序列分析發(fā)現(xiàn)預(yù)測的Mananos3氨基酸序列與鯉科魚類相似性較高, 同鮭科魚類、哺乳類、非脊椎動物和兩棲類的相似性較低。在進(jìn)化樹上, 其與鯉和斑馬魚被聚到同一分支上。雖然nanos3在不同物種間的序列差異較大, 但是其RNA結(jié)合功能域的氨基酸序列高度保守。定量和半定量PCR結(jié)果顯示,Mananos3具有母源表達(dá), 并在胚胎發(fā)育早期高量表達(dá), 而在PGCs特化完成后表達(dá)量逐漸減少。這種表達(dá)模式與斑馬魚[19]、家蠶(Bombyx mori)[17]、文昌魚(Branchiostoma)[18]非常相似。綜上,nanos3基因蛋白序列及其mRNA表達(dá)模式的保守性暗示nanos3在不同物種中可能具有相似的生物學(xué)功能。

早在2006年, Saito等[10]就使用斑馬魚nanos3基因的3′UTR序列插入到EGFP開放閱讀框下游, 介導(dǎo)EGFP在青鳉(Oryzias latipes)、泥鰍(Misgurnus anguillicaudatus)、金魚(Carassius auratus)等8種魚類的PGCs中特異穩(wěn)定的表達(dá)。在本研究中, 我們同樣發(fā)現(xiàn)mananos3-3′UTR和zfnanos3-3′UTR均可以標(biāo)記團頭魴和斑馬魚的PGCs。通過比較發(fā)現(xiàn), 利用mananos3-3′UTR標(biāo)記團頭魴本身的PGCs能使其他組織中的熒光(背景噪聲信號)更弱。因此,mananos3-3′UTR比zfnanos3-3′UTR更加適合團頭魴PGCs的特異性標(biāo)記, 這為將來開展基于團頭魴PGCs的遺傳操作提供便利。

EGFP-nanos3-3′UTR之所以能夠特異性標(biāo)記PGCs, 主要是由于兩個方面的分子機制共同作用。一方面, 在體細(xì)胞中, miR430能夠識別并結(jié)合到nanos3-3′UTR上的特殊位點從而介導(dǎo)mRNA的降解[20]。另一方面, 在PGCs中, 生殖細(xì)胞特異的RNA結(jié)合蛋白Dnd1能夠結(jié)合到nanos3-3′UTR上富含尿嘧啶區(qū)域從而保護(hù)mRNA免受miR430介導(dǎo)的RNA降解[21]。在本研究中, 我們在團頭魴nanos3-3′UTR中發(fā)現(xiàn)了一個非經(jīng)典的nanos3 miR430結(jié)合位點GCACUA, 對其進(jìn)行點突變后, 發(fā)現(xiàn)該序列的改變可以影響Mananos3-3′UTR對斑馬魚PGCs的標(biāo)記效率。所以我們推測,mananos3同樣存在通過miR430介導(dǎo)的mRNA降解及在生殖細(xì)胞中收到Dnd1蛋白保護(hù)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機制, 并且mananos3-3′UTR與miR430結(jié)合位點可能包含GCACUA。