何 麗 阮記明 劉 毅 付建平 劉 林 隗黎麗

(1. 江西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院, 南昌 330045; 2. 江西師范大學(xué)生命學(xué)院, 南昌 330022)

微囊藻毒素(Microcystins, 簡稱MCs)是一類具有生物活性的單環(huán)七肽化合物, 是銅綠微囊藻等藍藻產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物[1]。到目前為止, 在已知結(jié)構(gòu)的100多種MCs變體中, 微囊藻毒素-LR (Microcystin-LR, MC-LR, 其中L代表亮氨酸)是毒性最強、危害最嚴(yán)重的一種肝毒素[2]。此外, MC-LR還能夠在水生動物的腎臟、心臟、性腺和肌肉等組織器官中積累, 通過食物鏈的傳遞最終威脅人類健康[3,4], 已有的研究報道表明其主要的致毒機理是抑制絲∕蘇氨酸蛋白磷酸酶l和2A(PP1和PP2A)的活性以及誘導(dǎo)氧化應(yīng)激[5,6], 從而引起細胞骨架重組、DNA受損及氧化和抗氧化系統(tǒng)平衡失調(diào)等, 最終導(dǎo)致細胞凋亡和細胞壞死[7]。盡管已取得了一系列的研究進展, 但仍難以全面詮釋MC-LR毒性機制?，F(xiàn)已有零星報道表明自噬與MC-LR的肝毒性密切相關(guān), 如Menezes 等[8]發(fā)現(xiàn)人(Homo sapiens)的肝臟細胞暴露在低濃度的MC-LR中時, 可見自噬小體的產(chǎn)生; MC-LR也可引起小鼠(Mus musculus)肝細胞產(chǎn)生自噬[9]。然而, MC-LR誘導(dǎo)魚類自噬的研究相對較少, 其誘導(dǎo)自噬發(fā)生的機制也尚不明確。

已有的研究表明自噬是細胞體內(nèi)多余的蛋白質(zhì)和亞細胞成分在溶酶體內(nèi)消化降解的過程, 被認(rèn)為是一種選擇性的非caspase依賴的程序性細胞死亡[10]。大量研究表明, 自噬可由饑餓、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、低氧、病原體感染和細胞器受損等多種因素誘導(dǎo)[11], 該過程受30多種自噬相關(guān)基因的調(diào)控。其中Beclin1, 是酵母自噬相關(guān)基因Atg6的同源基因,是在1998年由Liang等在致死性Sinbis病毒性腦炎的大鼠(Rattus norvegicus)中發(fā)現(xiàn)的[12], 1999年Aita等[13]首次成功克隆了大鼠Beclin1基因。然而,Beclin1在魚類中的研究卻相對較少, 目前只有在斑馬魚(Danio rerio)[14]、牙鲆(Paralichthys olivaceus)[15]、荷包紅鯉(Cyprinus carpio)[16]和稀有鯽(Gobiocypris rarus)中[17]有相關(guān)報道。

草魚(Ctenopharygodon idella)作為一種重要的淡水經(jīng)濟魚類, 是我國養(yǎng)殖規(guī)模最大、產(chǎn)量最高的淡水養(yǎng)殖魚類, 在池塘集約化養(yǎng)殖模式下, 草魚極易遭受MCs的威脅。在我們先前的研究中, 經(jīng)轉(zhuǎn)錄組測序研究發(fā)現(xiàn), 草魚受MC-LR脅迫后, 肝臟差異表達基因中包括Beclin1等自噬相關(guān)基因[18]。此外,到現(xiàn)在為止還未見Beclin1在草魚中的克隆及其對MC-LR響應(yīng)的報道, 因此, 本文在此研究基礎(chǔ)上, 通過RACE-PCR技術(shù)獲得草魚Beclin1(命名為CiBeclin1)基因的全長cDNA序列, 并對其cDNA和推導(dǎo)的氨基酸進行了生物信息學(xué)分析, 同時分析在MCLR脅迫下草魚肝臟Beclin1基因的表達變化情況,為進一步研究MC-LR的毒性機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗草魚購于江西省南昌神龍漁業(yè)公司, 平均體重為(22.13±2.17) g。試驗所用MC-LR為 Taiwan Algal Science Inc 公司產(chǎn)品, 間氨基苯甲酸乙酯甲烷磺酸鹽(MS-222)為Sigma公司產(chǎn)品, RNA提取試劑盒TRIzol reagent為Invitrogen公司產(chǎn)品, 用于合成不同組織表達的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit 以及熒光定量PCR 的SYBR Green Real-time PCR Master Mix為Promega公司產(chǎn)品, 進行RACE擴增的第一鏈cDNA用Super SMART?PCR cDNA Synthesis Kit (Clontech)試劑盒合成、DL2000 DNA Marker、pMD18-T 載體和T4 DNA Ligase購自TaKaRa公司。

1.2 試驗魚的處理及樣品的分離

試驗草魚買回后先在室內(nèi)暫養(yǎng)2周, 暫養(yǎng)期間每日按照魚體重的2.0%進行投喂, 并保持水溫在(20 ± 0.2)℃。試驗前48h停止投喂并將草魚進行隨機分組, 即對照組和2個劑量處理組, 每組設(shè)置3個重復(fù)。在試驗前, 根據(jù)產(chǎn)品說明書將MC-LR (純度≥95%)粉末用甲醇溶解成1 μg/μL的母液保存?zhèn)溆? 在正式染毒之前用0.8%生理鹽水稀釋成為25 μg MC-LR/kg體重(25 μg MC-LR/kg body weight, 25 μg MC-LR/kg BW)和100 μg MC-LR/kg BW, 每尾魚注射量為0.1 mL, 對照組草魚注射等量的0.8%的生理鹽水。在染毒24h、48h、72h和96h后, 分別從實驗組和對照組中各取6尾魚。在解剖前, 先用100 μg/mL的MS-222將魚麻醉, 然后迅速分離新鮮的肝臟, 置于液氮中保存。

1.3 核酸的提取、單鏈cDNA及SMART cDNA合成

取出保存在液氮中的樣品, 采用Invitrogen公司的Trizol試劑盒提取總RNA, 具體提取方法參考試劑盒的說明書進行。用于RACE 擴增的cDNA按照Super SMART?PCR cDNA Synthesis Kit 操作手冊的方法合成, 用于檢測不同組織表達以及MC-LR誘導(dǎo)表達的第一鏈cDNA用RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit 試劑盒合成。

1.4 CiBeclin1 cDNA全長的獲得

根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)獲得Beclin1一段序列[18],先設(shè)計簡并引物驗證該EST序列(表1), 引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。PCR擴增條件為95℃預(yù)變性3min, 94℃ 30s, 58℃ 30s, 72℃ 90s, 共35個循環(huán), 72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳、切膠和回收純化后克隆到pMD18-T載體(TaKaRa, Tokyo, Japan) , 然后再轉(zhuǎn)化到感受態(tài)TOP10, 進行藍白斑篩選, 菌液PCR檢測陽性克隆,并送上海生工生物技術(shù)有限公司測序, 獲得中間片段。

CiBeclin1 cDNA 3′端片段克隆根據(jù)已獲得中間片段序列擴增共設(shè)計2條特異性引物RC3-1和RC3-2, 并且RC3-1在RC3-2的上游(表1)。擴增時,用RC3-1和3′RACE 接頭引物做第一次PCR擴增, 擴增條件為94℃預(yù)變性3min; 94℃ 30s, 58℃ 30s,72℃ 90s, 共20個循環(huán); 72℃延伸10min。產(chǎn)物稀釋后再用RC3-2和3′RACE 擴增試劑盒中的接頭引物做巢式PCR, 隨后篩選陽性克隆進行測序。

CiBeclin1 cDNA 5′端片段克隆根據(jù)已獲得中間片段序列而設(shè)計的特異性引物(RC5-1、RC5-2和RC5-3)(表1)。按照SMARTTMcDNA Amplification Kit (Clontech) 說明書推薦的反應(yīng)體系及反應(yīng)條件進行5′端擴增, 最后將獲得的5′擴增片段回收, 純化后連入pMD18-T載體, 轉(zhuǎn)化TOP10擴培, 挑選陽性克隆測序獲得基因5′端序列。

1.5 CiBeclin1序列分析與系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

利用ExPASy網(wǎng)站(http://www.expasy.org)的Translate和ProtParam程序分別進行氨基酸序列的推導(dǎo)和蛋白理化性質(zhì)的分析, 采用SignalP4.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/) 預(yù)測蛋白的信號肽; 跨膜區(qū)預(yù)測用TMpred (https://embnet.vital-it.ch/software /TMPRED_form.html)軟件, 使用InterProScan (http://www.ebi.ac.uk/interpro/search/sequence-search)在線分析CiBeclin1蛋白可能存在的結(jié)構(gòu)域。氨基酸序列比對用ClustalW1.81軟件分析, 系統(tǒng)發(fā)育樹則采用Mega7.0軟件中的N-J法進行構(gòu)建。

1.6 熒光定量PCR

取3尾草魚分離其肝臟、頭腎、脾臟、肝臟、腸道、心臟、胸腺、鰓、腦和肌肉組織各50—100 mg以及血液100 μL, 分別提取總RNA, 隨后取1 μg RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA作為檢測CiBeclin1在不同組織中的表達。另外, 取出液氮中保存的經(jīng)不同劑量MC-LR處理的對照組和實驗組草魚肝臟組織提取總RNA, 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA, 用于分析MCLR對草魚肝臟CiBeclin1表達的影響。使用Quantitative real-time PCR (qRT-PCR)方法檢測CiBeclin1的表達量, 并以草魚β-actin作為內(nèi)參基因進行校正,CiBeclin1和β-actin引物見表1。qRT-PCR反應(yīng)在伯樂公司CFX96 TouchTMReal-Time PCR Detection System上完成。20 μL PCR反應(yīng)體系包括5.0 μL 50倍稀釋的cDNA模板, 10 μL SYBR Green Realtime PCR Master Mix, 上下游引物各0.5 μL, 4.0 μL ddH2O。反應(yīng)條件: 94 ℃變性5min, 94℃ 10s, 58℃15s, 72℃ 20s 進行45個循環(huán)后, 72℃延伸5min。采用2-ΔΔCt法計算CiBeclin1基因的相對表達量。

1.7 數(shù)據(jù)分析

實驗數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,CiBeclin1在不同組織中的相對表達采用One-way ANOVA分析(SPSS 16.0), MC-LR對CiBeclin1表達的影響采用多因素方差分析進行統(tǒng)計學(xué)檢驗(SPSS 16.0), 統(tǒng)計學(xué)顯著性水平設(shè)定P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 CiBeclin1基因全長cDNA序列特征分析

根據(jù)草魚轉(zhuǎn)錄組測序得到一段長約1000 bpBeclin1的序列, 隨后設(shè)計引物對該段序列進行驗證并在NCBI 上進行BLAST 分析, 進一步確定為CiBeclin1 cDNA的中間序列, 隨后通過RACE法擴增CiBeclin1基因的5′和3′末端序列。經(jīng)序列拼接獲得全長序列。CiBeclin1基因全長1590 bp, 包括5′非編碼區(qū)和3′非編碼區(qū), 分別為54 bp和192 bp, 開放閱讀框(Open reading frame, ORF)為1344 bp, 其在GenBank 上的登錄號為MG797682。對其cDNA序列進行分析, 發(fā)現(xiàn)該序列含有ATTAAA Ploy(A)加尾信號。對其編碼氨基酸序列預(yù)測分析, 發(fā)現(xiàn)CiBeclin1含有447個氨基酸, 分子量為51.2 kD, 理論等電點為4.88, 無信號肽。結(jié)構(gòu)域分析表明,CiBeclin1蛋白有一個Bcl2同源結(jié)構(gòu)域3(BH3, 111—120 aa)和一個進化保守結(jié)構(gòu)域(ECD, 238—447 aa),并有一段不完整的富含亮氨酸的出核序列(LX3LX2LXX, 177—186 aa), 此外, 在http://smart.embl-heidelberg.de/上還預(yù)測到CiBeclin1蛋白有一個卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域(CCD, 171-211 aa)。

表1 CiBeclin1基因擴增和表達的引物Tab. 1 Primers used to amplify and express CiBeclin1 gene

2.2 CiBeclin1氨基酸同源性與系統(tǒng)進化分析

應(yīng)用MEGA7.0軟件Neighbor-joining(NJ)法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹(圖1),CiBeclin1與稀有鯽的Beclin1進化關(guān)系最近, 首先聚為一小支, 之后與斑馬魚和鯉魚聚類形成一支, 再與其他魚類聚為一大支。哺乳類、兩棲類、爬行類和鳥類等其他動物聚為另一大支。

2.3 CiBeclin 1 基因組織分布特征分析

通過qRT-PCR方法研究了CiBeclin1在肝、腎、頭腎、脾、腸、心臟、鰓、肌肉、皮膚以及血液10種組織中的表達, 結(jié)果表明,CiBeclin1在所檢測的組織中均可表達, 呈組成型表達(圖2)。在肝臟中的表達量最為豐富, 其次為肌肉, 在頭腎中表達量相對較低。以相對表達量最低的頭腎作為參照進行One-way ANOVA分析, 肝臟、肌肉、腸道以及心臟中CiBeclin1的表達量顯著高于頭腎表達量(P＜0.05)。

2.4 微囊藻毒素-LR對草魚肝臟CiBeclin1 mRNA水平的影響

草魚暴露于不同劑量MC-LR(25和100 μg MCLR/kg BW)不同時間后(圖3), 不同MC-LR誘導(dǎo)劑量對CiBeclin1 mRNA表達水平的影響差異顯著(F=170.811,P=0.000), MC-LR誘導(dǎo)不同時間(24h、48h、72h和96h)對CiBeclin1 mRNA水平的影響也有顯著差異(F=4.733,P=0.004); 作用濃度和作用時間之間有交互作用(F=3.967,P=0.002)。注射MCLR 24h, 48h, 72h和96h后, 2個劑量誘導(dǎo)組與對照組相比, 表達均顯著下調(diào)(P＜0.05); 但誘導(dǎo)96h 后, 100 μg MC-LR/kg BW劑量組中CiBeclin1表達量相對于誘導(dǎo)24h、48h和72h的表達量有上升的趨勢, 但仍顯著低于對照組(P＜0.05)。

3 討論

3.1 CiBeclin1基因cDNA全長的克隆及生物信息學(xué)分析

目前, 細胞自噬已成為生命科學(xué)研究領(lǐng)域的熱點問題。然而, 自噬相關(guān)研究在魚類中較少有報道。Beclin1作為細胞自噬的重要的調(diào)節(jié)因子, 在細胞自噬過程中發(fā)揮著重要作用[19]。本研究成功克隆了草魚CiBeclin1基因的全長cDNA序列, 其包含一個1344 bp的開放閱讀框, 編碼447個氨基酸, 含有一個BH3結(jié)構(gòu)域和一個ECD結(jié)構(gòu)域, 這兩個結(jié)構(gòu)域在人類和哺乳類的Beclin1序列中也有[20], 對荷包紅鯉和牙鲆Beclin1結(jié)構(gòu)域的研究同樣發(fā)現(xiàn)有這2個結(jié)構(gòu)域[15—17]。與其他脊椎動物不同, 魚類Beclin1基因的BH3結(jié)構(gòu)域的117位氨基酸由絲氨酸取代了甘氨酸[16]。在酵母和哺乳動物細胞中, 抗凋亡蛋白家族成員如Bcl-2以及Bcl-XL等能與Beclin1 BH3結(jié)構(gòu)域處結(jié)合而抑制自噬的形成[21], 此外,Beclin1的ECD結(jié)構(gòu)域與Vps34結(jié)合誘導(dǎo)其他自噬相關(guān)蛋白定位于該蛋白復(fù)合體參與自噬的形成[22]。推測草魚中的Beclin1可能發(fā)揮著同樣調(diào)控自噬水平的功能。除此之外,CiBeclin1蛋白還有一個預(yù)測的卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域(CCD), 位于171—211 aa, 這與稀有鯽Beclin1的報道一致[17], 然而草魚和稀有鯽CCD 結(jié)構(gòu)域均由 41 個氨基酸殘基構(gòu)成, 而人類的由 97 個氨基酸組成[23]。CiBeclin1經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)其也具有一個41個氨基酸組成的CCD結(jié)構(gòu)域。另外,CiBeclin1基因沒有出核信號序列(PKKKRKV), 然而, 在177—186 aa位置有一段不完整的富含亮氨酸的出核序列(LX3LX2LXX, 其中X代表任何氨基酸),這與牙鲆和稀有鯽Beclin1的結(jié)構(gòu)也相似[15], 另外, 該結(jié)構(gòu)在人類和哺乳類的Beclin1序列中也有[20]。經(jīng)過氨基酸同源性比對分析,CiBeclin1氨基酸序列與已報道的物種的氨基酸具有較高的相似性和一致性, 其中與稀有鯽氨基酸序列的相似性最高為98%。由以上分析可知,CiBeclin1蛋白序列和結(jié)構(gòu)與其他魚類及哺乳動物都比較相似。

圖1 草魚及其他脊椎動物Beclin1基因的系統(tǒng)進化樹Fig. 1 Phylogenetic tree of Beclin1 of grass carp and other species

圖2 CiBeclin1的組織特異性表達分析Fig. 2 Tissue-specific expression of CiBeclin1 mRNA in grass carp

圖3 MC-LR對草魚肝臟CiBeclin1表達的影響Fig. 3 The effects of MC-LR on the expression of CiBeclin1 in liver of grass carp

3.2 CiBeclin1基因在不同組織中的表達分析

已有的研究報道表明,Beclin1可在健康牙鲆腦、鰭條、心臟、肝臟、腸道、胃和腎臟組織中廣泛表達[15], 對稀有鯽Beclin1的表達分析也發(fā)現(xiàn)其可在不同組織中表達[17]。本研究同樣發(fā)現(xiàn)CiBe-clin1也在所有檢測的組織中表達, 包括肝、腎、頭腎、脾、腸、心臟、鰓、肌肉、皮膚以及血液。Beclin1在各組織中的廣泛表達提示了它在魚類中具有非常重要的作用。

3.3 MC-LR對草魚肝臟CiBeclin1 mRNA水平的影響

目前的研究報道表明細胞自噬除了在維持細胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)以及調(diào)節(jié)細胞的生長、分化和發(fā)育中起著重要作用外[24], 還在抵抗外界各種刺激,如饑餓、紫外線輻射、缺氧、病原體感染以及環(huán)境污染等方面起著自我保護作用[25—27]。其中有一些研究通過Beclin1的表達變化探討了自噬在機體抵御環(huán)境污染物中的影響, 如Gao 等[16]檢測了鎘暴露后荷包紅鯉腎臟組織中Beclin1基因的表達情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在鎘暴露后, 腎臟中Beclin1 mRNA和蛋白水平都有劑量和時間依賴性的升高, 因此作者認(rèn)為Beclin1在應(yīng)對鎘的生物毒性上具有一定的作用。盡管MC-LR引起機體自噬的報道不多, 但有文獻報道從微囊藻中提取的MC-LR可誘導(dǎo)腎Vero-E6細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)空泡形成, 自噬小體大量聚集[28]。在原代培養(yǎng)的支持細胞中, 電鏡結(jié)果顯示MC-LR能夠引起自噬小體增多, 說明MC-LR能促進自噬的發(fā)生[29]。也有研究報道Cho細胞經(jīng)2.5、5和10 μmol/L MCLR處理后,Beclin1 表達升高, 且與對照組相比, 差異都有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05), 并通過一系列實驗證實了MC-LR誘導(dǎo)的自噬作為一種保護機制可抑制凋亡的發(fā)生[30]。然而, 吳珍等[9]采用qRT-PCR 分別檢測自噬相關(guān)基因Beclin1 和LC3α的轉(zhuǎn)錄水平, 結(jié)果發(fā)現(xiàn), MC-LR 在上調(diào)LC3α的同時, 抑制了Beclin1 的轉(zhuǎn)錄水平, 這與本實驗結(jié)果類似。本研究通過qRT-PCR檢測到不同劑量MC-LR誘導(dǎo)草魚后,CiBeclin1的表達均被顯著抑制。這些結(jié)果表明Beclin1在受到MC-LR脅迫后, 其表達會產(chǎn)生變化, 但在今后我們還需要更多的實驗進一步驗證Beclin1在抵御MC-LR脅迫中的具體作用。