于非非 鐘智明 牛素芳 杜曉東 許開航 林子騰 張穎懿 王家晉 劉漫玲

(廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院, 湛江 524088)

櫛江珧(Atrina pectinata), 隸屬于軟體動(dòng)物門(Mollusca), 瓣鰓綱(Lamellibranchia), 貽貝目(Mytiloida), 江珧科(Pinnidae), 江珧?qū)?Atrina)[1], 有帶子、大海紅、海锨、大海蕎麥、土杯、馬蹄等俗稱。櫛江珧?yàn)橐环N廣溫、廣鹽的穩(wěn)居性貝類, 廣泛分布于溫、熱帶泥沙質(zhì)近海地區(qū), 我國(guó)的渤海、黃海、東海和南海四大海域均有分布, 其中南海是我國(guó)櫛江珧分布種類最多、產(chǎn)量最高的海區(qū)[1]。櫛江珧閉殼肌肥大、肉質(zhì)鮮嫩, 具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和藥用價(jià)值[2], 在我國(guó)南海沿岸地區(qū)備受歡迎。然而, 櫛江珧的人工養(yǎng)殖技術(shù)尚不完善, 一般采用半人工養(yǎng)殖方法, 即采捕野生櫛江珧苗種、然后選擇合適海區(qū)進(jìn)行集中養(yǎng)殖的方式[3]。多年的過(guò)度捕撈和人工養(yǎng)殖的相對(duì)滯后使櫛江珧的野生資源遭到大量破壞, 種質(zhì)資源明顯退化[4]。這與南海沿岸日益上升的需求量相違背, 對(duì)南海櫛江珧資源進(jìn)行調(diào)查和保護(hù)成為亟待解決的科學(xué)問(wèn)題。

細(xì)胞色素氧化酶亞單位Ⅰ(Cytochrome Oxidase Ⅰ,COⅠ)是一種線粒體DNA標(biāo)記, 因其結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、進(jìn)化速度快、母系遺傳、易于擴(kuò)增等特點(diǎn),被廣泛應(yīng)用于不同生物群體的遺傳多樣性分析[5]。近年來(lái)有研究者基于COⅠ序列對(duì)不同地理位置櫛江珧的群體遺傳性進(jìn)行了分析, 如嚴(yán)加坤等[4]調(diào)查了長(zhǎng)島、日照、文登、湛江、?？谖鍌€(gè)城市的野生櫛江珧資源, 發(fā)現(xiàn)南方群體和北方群體之間存在極大遺傳分化, 而南北方群體內(nèi)部幾乎沒(méi)有遺傳分化。Xue等[6]利用COⅠ基因分析了遼寧獐子島、山東蓬萊、山東劉公島、山東榮成、山東紅島、山東日照、江蘇連云港、浙江舟山、福建福州和韓國(guó)海州(Haeju)8個(gè)地區(qū)的櫛江珧資源, 發(fā)現(xiàn)來(lái)自中國(guó)北方海域的7個(gè)群體雖然遺傳多樣性較高, 但沒(méi)有遺傳分化; 而中國(guó)和韓國(guó)樣品間存在明顯的遺傳分化。以上利用COⅠ基因?qū)苯虻难芯慷嗑劢乖谥袊?guó)北部海域, 或者更關(guān)注南北方海域群體的差異, 而對(duì)于櫛江珧分布種類最多、產(chǎn)量最高的南海北部海域群體內(nèi)部的資源調(diào)查研究較少。

本研究基于COⅠ基因序列對(duì)我國(guó)南海北部7個(gè)沿海城市的櫛江珧群體進(jìn)行群體遺傳學(xué)研究,從遺傳多樣性、遺傳分化和歷史動(dòng)態(tài)探討南海北部櫛江珧的系統(tǒng)地理格局, 以期闡明南海北部櫛江珧的群體遺傳特征, 評(píng)估其遺傳資源狀況, 為資源保護(hù)、人工養(yǎng)殖和良種選育提供理論儲(chǔ)備。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

采集了汕頭(ST)、陽(yáng)江(YJ)、湛江(ZJ)、海口(HK)、瓊海(QH)、北海(BH)、防城港(FCG)近海等7個(gè)海區(qū)野生群體, 共191只櫛江珧個(gè)體(圖1和表1)。對(duì)所有樣品進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定后取其閉殼肌,-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

圖1 南海北部櫛江珧7個(gè)群體的采樣地點(diǎn)Fig. 1 Sample locations for seven A. pectinata populations from the Northern South China Sea

表1 南海北部櫛江珧7個(gè)群體的采樣信息和遺傳多樣性參數(shù)Tab. 1 The sampling information and genetic diversity indices for 7 A. pectinata populations from the Northern South China Sea

1.2 DNA提取和目的基因的擴(kuò)增

用E.Z.N.A.R Tissue DNA試劑盒(OMEGA)提取各樣品基因組DNA, 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的純度和濃度。COⅠ基因片段擴(kuò)增所用引物序列為: LCO1490 (GGTCAACAAATCATAAA GATATTGG)和HCO2198 (TAAACTTCAGGGT GACCAAAAAATCA)。PCR反應(yīng)體系為25 μL 2×EasyTaqPCR SuperMix (TransGen)、正反引物(10 μmol/L)各1 μL, 基因組DNA (100 ng/μL) 2 μL,ddH2O補(bǔ)齊50 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)? 94℃預(yù)變性3min; 94℃變性30s, 57℃退火30s, 72℃延伸1min,35個(gè)循環(huán); 最后72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后由生工測(cè)序。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用DNAStar 7.1和Clustal X 1.81[7]進(jìn)行序列校對(duì)和編輯; 利用DnaSP 5.10.01[8]計(jì)算單倍型數(shù)目、單核苷酸變異位點(diǎn)數(shù)和多態(tài)簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)數(shù);利用Arlequin 3.5.1.2[9]統(tǒng)計(jì)序列的平均堿基組成, 計(jì)算單倍型多樣性(h)和核苷酸多樣性(π)等群體遺傳學(xué)參數(shù); 利用MEGA 6.06[10]計(jì)算轉(zhuǎn)換百分比、顛換百分比和轉(zhuǎn)換/顛換比率(Ts/Tv), 選擇DNA序列的最佳替換模型。利用MrBayes 3.2.6構(gòu)建單倍型系統(tǒng)進(jìn)化樹, 利用Network5.0.0.1(http://www.fluxus-engineering.com/share-net.htm)中的中介連接網(wǎng)絡(luò)法構(gòu)建單倍型網(wǎng)絡(luò)支系圖[11]

群體遺傳結(jié)構(gòu)采用3種方法進(jìn)行分析: (1)采用分化固定指數(shù)Fst評(píng)價(jià)兩兩群體間的遺傳差異, 檢驗(yàn)結(jié)果的顯著性; (2)根據(jù)樣品來(lái)源、遺傳學(xué)參數(shù)和Fst, 將7個(gè)櫛江珧群體劃分為2個(gè)組: 汕頭(ST)、陽(yáng)江(YJ)、湛江(ZJ)、?？?HK)、瓊海(QH)和北海(BH)6個(gè)櫛江珧群體為一組(L1組), 防城港群體(FCG)單獨(dú)為一組(L2組), 通過(guò)AMOVA分析估算遺傳變異在組群間、組群內(nèi)群體間和群體內(nèi)的分布,進(jìn)行顯著性分析; (3)通過(guò)Exact檢驗(yàn)檢測(cè)單倍型在群體間分布頻率的差異。

群體歷史動(dòng)態(tài)采用2種方法進(jìn)行檢測(cè): (1)采用Tajima'sD檢驗(yàn)和Fu'sFs檢驗(yàn)檢測(cè)中性假說(shuō)是否成立, 并進(jìn)行顯著性分析; (2)基于核苷酸不配對(duì)分布檢驗(yàn)?zāi)虾１辈繖苯蛉后w是否存在數(shù)量和空間擴(kuò)張, 并通過(guò)擬合優(yōu)度檢驗(yàn)(Goodness of fit test)檢測(cè)核苷酸不配對(duì)的觀測(cè)分布和預(yù)期分布之間的一致性, 并估算群體歷史擴(kuò)張時(shí)間。在本研究中,COⅠ基因的分化速率采用2.4%/MY (Million year, MY)[6],世代時(shí)間設(shè)置為1年[12]。

2 結(jié)果

2.1 序列分析

本研究共獲得7個(gè)群體191條長(zhǎng)度為600 bp的COⅠ基因部分序列, 其G、C、A、T的平均含量分別為24.05%、14.81%、19.18%和41.96%。共檢測(cè)到113個(gè)核苷酸變異位點(diǎn)(18.8%), 包括14個(gè)單核苷酸變異位點(diǎn), 99個(gè)多態(tài)簡(jiǎn)約信息位點(diǎn), 無(wú)插入和缺失位點(diǎn)。轉(zhuǎn)換數(shù)共有107次, 明顯高于顛換數(shù)(19次),Ts/Tv=15.33。轉(zhuǎn)換和顛換在G、C、A、T之間均有發(fā)生, 其中C-T (53.68%)轉(zhuǎn)換多于G-A(40.88%)轉(zhuǎn)換, T-G (1.79%)和T-A (1.66%)顛換稍多于C-G (1.05%)和C-A (0.92%)顛換。突變位點(diǎn)均勻地分布在COⅠ基因上, 但在群體間的分布差異較大, 77個(gè)多態(tài)位點(diǎn)來(lái)源于FCG群體。

2.2 單倍型和遺傳多樣性分析

COⅠ單倍型在7個(gè)群體中的分布見表1和表2。113個(gè)核苷酸變異位點(diǎn)共定義73個(gè)單倍型(Gen-Bank登錄號(hào)為MH536017—MH536089), 包括58個(gè)獨(dú)有單倍型和15個(gè)共享單倍型。在共享單倍型中,3個(gè)單倍型(H23、H36和H44)為6個(gè)群體所共有,1個(gè)單倍型(H2)為5個(gè)群體所共享, 1個(gè)單倍型(H29)為3個(gè)群體所共享, 10個(gè)單倍型(H1、H18、H20、H34、H47、H51、H52、H54、H61和H62)為2個(gè)群體所共享。H44出現(xiàn)的頻率最高(占總樣品的31.41%), 這表明這個(gè)單倍型是南海北部櫛江珧在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中形成的較為穩(wěn)定的優(yōu)勢(shì)基因型。值得注意的是, 防城港群體具有9個(gè)單倍型(H65-H73), 均為獨(dú)有單倍型。

表2 南海北部櫛江珧7個(gè)群體的單倍型分布情況Tab. 2 Haplotype distribution of 7 A. pectinata populations from the Northern South China Sea

續(xù)表2

遺傳多樣性參數(shù)如表1所示, 南海北部櫛江珧總?cè)后w的單倍型多樣性和核苷酸多樣性分別為0.8996和0.0257, 表明南海北部櫛江珧群體的遺傳多樣性目前仍處于較高的水平。在7個(gè)群體中,L1組6個(gè)群體的單倍型多樣性為0.8133—0.9286, 核苷酸多樣性為0.0033—0.0045, 表現(xiàn)出高h(yuǎn)低π遺傳多樣性模式; 而防城港群體的單倍型多樣性為0.8148, 核苷酸多樣性較高(0.0219), 表現(xiàn)出高h(yuǎn)高π遺傳多樣性模式。

2.3 群體遺傳學(xué)關(guān)系分析

以旗江珧(Atrina vexillum)COⅠ基因序列為外群, 構(gòu)建櫛江珧73個(gè)單倍型的貝葉斯推理樹(圖2)。結(jié)果顯示, L1組6個(gè)群體的各單倍型交叉出現(xiàn)在系統(tǒng)發(fā)育樹中, 并未表現(xiàn)出與地理位置相對(duì)應(yīng)的譜系結(jié)構(gòu); L2組的獨(dú)有單倍型(H65-H73)聚為一個(gè)獨(dú)立的進(jìn)化分支, 顯示了較遠(yuǎn)的遺傳距離。單倍型網(wǎng)絡(luò)支系圖(圖3)具有1個(gè)主體單倍型(H44), 該主體單倍型在6個(gè)群體中均有分布, 且出現(xiàn)頻率較高,說(shuō)明它可能是起源于母系祖先的主體單倍型; 其他單倍型呈輻射狀分布在主體單倍型周圍, 其中L2組的9個(gè)獨(dú)有單倍型作為一個(gè)獨(dú)立分支, 與其他單倍型具有較遠(yuǎn)的遺傳距離。這暗示著南海北部櫛江珧北部灣的防城港群體與其他群體間存在顯著的遺傳結(jié)構(gòu)。

圖2 南海北部櫛江珧COⅠ單倍型貝葉斯推理樹Fig. 2 Bayesian inference tree for A. pectinata from the Northern South China Sea based on COⅠ

2.4 群體遺傳結(jié)構(gòu)

由表3可知, L1組6個(gè)群體間的Fst值均較小(-0.0200— -0.0055), 且統(tǒng)計(jì)學(xué)差異不顯著(P＞0.05);但L 2組與L 1組6個(gè)群體間的Fst值均較大(0.8729—0.8821), 且統(tǒng)計(jì)學(xué)差異極顯著(P＜0.01)。分子方差分析(Analysis of molecular variance, AMOVA)結(jié)果顯示(表4), 組群間、組群內(nèi)群體間和群體內(nèi)個(gè)體間的遺傳變異比例分別為97.01%、-0.1%和3.09%, 組群間、組群內(nèi)群體間和群體內(nèi)個(gè)體間的固定系數(shù)Fct、Fsc和Fst分別為0.9701 (P＞0.05)、-0.0324 (P＞0.05)和0.9691 (P＜0.01)。Fst值和AMOVA結(jié)果表明, L1組6個(gè)群體間在分子水平不存在明顯的遺傳分化, 但L2組與L1組6個(gè)群體間存在顯著遺傳分化。Exact檢驗(yàn)結(jié)果顯示, 單倍型在L1組6個(gè)群體間的分布頻率并無(wú)顯著差異, 但在L2組與L1組間差異顯著。

圖3 南海北部櫛江珧COⅠ單倍型支系圖Fig. 3 Haplotype network of A. pectinata from the Northern South China Sea based on COⅠ

表3 南海北部櫛江珧7個(gè)群體間的遺傳分化指數(shù)FstTab. 3 The pairwise Fst among seven populations of A. pectinata from the Northern South China Sea

表4 南海北部櫛江珧7個(gè)群體間的AMOVA分析Tab. 4 Analysis of molecular variance (AMOVA) among seven populations of A. pectinata from the Northern South China Sea

2.5 群體歷史動(dòng)態(tài)

由于FCG群體與其他6個(gè)群體間具有顯著的遺傳分化, 故將FCG群體單獨(dú)進(jìn)行歷史動(dòng)態(tài)分析。中性檢驗(yàn)結(jié)果顯示, FCG群體所在L2組的Tajima'sD檢驗(yàn)(D= -1.4320,P=0.0565)為不顯著負(fù)值, Fu'sFs檢驗(yàn)(Fs=4.9540,P=0.9620)為不顯著正值, 說(shuō)明FCG群體進(jìn)化符合中性假說(shuō)。L1組6個(gè)群體間無(wú)顯著的遺傳分化, 故將其合并為一個(gè)大群體進(jìn)行歷史動(dòng)態(tài)分析。結(jié)果顯示, Tajima'sD檢驗(yàn)(D= -2.3190,P=0)和Fu'sFs檢驗(yàn)(Fs= -26.8316,P=0)均為顯著負(fù)值。基于數(shù)量擴(kuò)張模型和空間擴(kuò)張模型的核苷酸不配對(duì)分布均呈單峰分布(圖4), 且觀測(cè)分布和期望分布擬合優(yōu)度較好(SSD),Hri值小且不顯著(表5)。中性檢驗(yàn)和核苷酸不配對(duì)分布結(jié)果均提示南海北部櫛江珧L1組6個(gè)群體在歷史上可能發(fā)生過(guò)數(shù)量和棲息地?cái)U(kuò)張事件。數(shù)量擴(kuò)張模型和空間擴(kuò)張模型下的τ值分別為1.2830和1.0880 (表5), 據(jù)此推算南海北部櫛江珧群體擴(kuò)張時(shí)間約在75500—89000年前。

圖4 南海北部櫛江珧總?cè)后wCOⅠ核苷酸不配對(duì)分布圖Fig. 4 Mismatch distributions of A. pectinata from the Northern South China Sea based on COⅠ

表5 南海北部櫛江珧總?cè)后wCOⅠ核苷酸不配對(duì)分布參數(shù)Tab. 5 Mismatch distribution indices of A. pectinata from the Northern South China Sea based on COⅠ

3 討論

3.1 群體遺傳多樣性

單倍型多樣性(h)和核苷酸多樣性(π)是衡量物種遺傳多樣性的2個(gè)重要指標(biāo)[13]。在本研究中, 南海北部櫛江珧L1組群呈現(xiàn)出較高的單倍型多樣性(0.8133—0.9286)和較低的核苷酸多樣性(0.0033—0.0045), 即高h(yuǎn)低π模式。這種高h(yuǎn)低π的遺傳參數(shù)特征通常是由一個(gè)較小的有效群體經(jīng)過(guò)近期快速擴(kuò)張成一個(gè)大的群體所引起的[14]。在末次冰盛期, 南海海平面下降約100—120 m, 變成一個(gè)半封閉的內(nèi)陸海(圖1), 成為眾多海洋生物的冰期避難所[15,16]。在冰期惡劣的環(huán)境下, 南海櫛江珧的分布范圍和數(shù)量可能經(jīng)歷了一定程度的收縮; 隨著間冰期氣溫回升, 海平面上升, 產(chǎn)生大量近岸棲息地, 冰期避難所內(nèi)殘留的櫛江珧可能發(fā)生快速擴(kuò)張重新進(jìn)入南海大陸架。此過(guò)程南海櫛江珧群體積累了單倍型的多樣性, 但尚缺乏足夠的時(shí)間積累核苷酸序列的多樣性[11]。而防城港群體顯示了較高的單倍型多樣性(0.8148)和核苷酸多樣性(0.0219), 這暗示著北部灣豐富的生態(tài)資源和相對(duì)穩(wěn)定的生存環(huán)境對(duì)櫛江珧保持遺傳多樣性產(chǎn)生了重要影響。

單倍型多樣性和核苷酸多樣性分析結(jié)果表明,南海北部櫛江珧群體的遺傳多樣性目前仍處于較高的水平, 這可能與櫛江珧廣闊的生境范圍有關(guān)。櫛江珧在我國(guó)東海、渤海、黃海和南海海域均有分布, 廣闊的生境范圍使其面臨較小的自然選擇壓力, 積累較多的遺傳變異。雖然自第四紀(jì)以來(lái), 全球溫度的大幅度升降使許多物種的遺傳多樣性損失嚴(yán)重[17], 但櫛江珧作為一種底棲動(dòng)物可能受到的影響較小, 保留了較高的遺傳多樣性。

3.2 群體遺傳結(jié)構(gòu)

在本研究中, AMOVA分析、Fst值、單倍型系統(tǒng)發(fā)育樹和網(wǎng)絡(luò)支系圖結(jié)果均表明, L1組6個(gè)櫛江珧群體的遺傳差異不顯著, 不存在顯著的群體遺傳結(jié)構(gòu)。造成L1組6個(gè)群體遺傳分化不顯著的原因可能有三點(diǎn): 一是擴(kuò)散生活史特征。對(duì)于有幼蟲階段的海洋生物, 浮游期(Pelagic larval duration, PLD)對(duì)于基因交流和遺傳結(jié)構(gòu)具有重要影響[18,19]。櫛江珧的浮游期約30d左右, 比櫛孔扇貝(Chlamys farreri)(約15d)、中國(guó)蛤蜊(Mactra chinensis)(約10d)等雙殼類具有更長(zhǎng)的浮游期[18], 這暗示著櫛江珧具有較強(qiáng)的擴(kuò)散能力, 可以越過(guò)地理環(huán)境和水深條件,產(chǎn)生更多的基因交流。二是洋流的輸送作用。南海沿岸櫛江珧5月份進(jìn)入成熟期和排放期, 排放期可一直延續(xù)到12月份, 在此期間櫛江珧的性腺分批多次排放[20]。西南季風(fēng)漂流、南海暖流、粵東沿岸流和海南島以東沿岸流等北向海流[21,22]有利于QH、ZJ等地方群體卵和幼蟲的的北上擴(kuò)散; 而東北季風(fēng)漂流、廣東沿岸流和黑潮南海分支等南向海流[21,22]則可促進(jìn)ST群體向南遷移, 從而進(jìn)行基因交流。三是目前一般認(rèn)為海洋生物是從海洋到陸地的遷移方式, 陸地周圍的淡水、濁流和人類活動(dòng)對(duì)生物體的擴(kuò)散形成一個(gè)地理和生態(tài)的障礙[23]。但櫛江珧適應(yīng)能力強(qiáng), 從潮下帶到水下100 m、泥質(zhì)或砂質(zhì)海區(qū)皆可分布[24,25], 這意味著櫛江珧比其他貝類具有更強(qiáng)的克服地理和生態(tài)障礙的能力, 能夠被洋流輸送更遠(yuǎn)的距離, 產(chǎn)生更多的基因交流。

值得一提的是防城港群體與其他6個(gè)群體間產(chǎn)生了明顯的遺傳分化, 具有顯著的遺傳結(jié)構(gòu), 有3個(gè)可能的解釋: 一是北部灣是一個(gè)半封閉的海域, 位于大陸架邊緣, 于古近系斷陷期形成, 南海櫛江珧很可能在此時(shí)期發(fā)生了分化[26], 其中L1組群隨后進(jìn)行了大規(guī)模擴(kuò)散, 而防城港群體由于地理位置所限,擴(kuò)散程度則相對(duì)較小, 經(jīng)過(guò)多年積累形成了遺傳分化。二是基于生態(tài)競(jìng)爭(zhēng)不相容原理。當(dāng)兩個(gè)相近的物種或個(gè)體共存于一個(gè)相對(duì)狹小的生境中時(shí), 他們可能會(huì)劃分生存空間和食物資源, 以最大程度地減少生態(tài)位重疊和競(jìng)爭(zhēng)[27,28]。長(zhǎng)期空間和食物的差異導(dǎo)致兩個(gè)物種最終產(chǎn)生遺傳分化, 尤其體現(xiàn)在防城港群體和北海群體間。三是北部灣的自然資源對(duì)于櫛江珧群體而言非常豐富, 尤其是紅河的匯入帶來(lái)了豐富的海底沉積物。北部灣的紅樹林資源亦很豐富, 空間異質(zhì)性強(qiáng), 可以作為雙殼類幼蟲的天然屏障, 不但給幼蟲提供了多樣性的食物和小生境, 也減少其他物種對(duì)幼蟲的掠奪[26,29], 從而使北部灣狹小空間內(nèi)產(chǎn)生多樣性的系統(tǒng)分化成為可能。

3.3 資源管理

目前, 南海北部櫛江珧種質(zhì)資源明顯退化[4], 而物種的遺傳多樣性是生存和進(jìn)化的前提, 豐富的遺傳多樣性意味著較大的進(jìn)化潛力, 也是生物適應(yīng)環(huán)境變化的必要條件[30]。本研究表明, 北部灣防城港櫛江珧群體COⅠ的遺傳多樣性水平較高; 汕頭、陽(yáng)江、湛江、海口、瓊海和北海6個(gè)群體的遺傳多樣性相對(duì)偏低, 其中?？谌后w的遺傳多樣性最低。為避免櫛江珧種質(zhì)資源嚴(yán)重衰退的現(xiàn)象, 應(yīng)當(dāng)加強(qiáng)櫛江珧的管理和保護(hù), 尤其是面臨較大捕撈壓力的南海北部沿岸群體。