張玉倩 劉笑迎 賈巖輝 王群 陳婡 王長(zhǎng)德 曲紅

1山東省濱州市中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 251700;2上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬上海市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 200082

腦內(nèi)微小病變作為腦卒中發(fā)病的預(yù)測(cè)因子，對(duì)腦卒中的一級(jí)預(yù)防起至關(guān)重要的作用，也因此受到學(xué)者們的廣泛關(guān)注[1]。腦內(nèi)微小病變的提出源于擴(kuò)大的血管周圍間隙(VRS)，是指在頭顱MRI的T2加權(quán)(T2WI)上見到的直徑3 mm以下的邊緣整齊、境界清楚、不伴有周圍信號(hào)改變的影像學(xué)表現(xiàn)[2]。其病理改變包括腦梗死灶、陳舊性出血病灶、血管周圍間隙、脫髓鞘、神經(jīng)膠質(zhì)化、纖維化、細(xì)胞浸潤(rùn)等[3]。糖尿病作為腦卒中的常見危險(xiǎn)因素之一，與腦內(nèi)微小病變的形成關(guān)系尤其密切[4]。糖尿病促進(jìn)腦內(nèi)微小病變的發(fā)病機(jī)制及病理改變暫不清楚。目前尚無腦內(nèi)微小病變的動(dòng)物模型，研究主要借鑒腦小血管疾病的動(dòng)物模型。本研究旨在建立一個(gè)糖尿病性腦內(nèi)微小病變的大鼠模型，并對(duì)其病理學(xué)改變進(jìn)行分析。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 健康雄性1月齡Wistar大鼠共12只，由上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，體質(zhì)量80～90 g。采用隨機(jī)數(shù)字表法分為正常對(duì)照組(n=6)和模型組(n=6)。

1.2 造模

1.2.1 糖尿病大鼠造模方法 參照趙寶珍等[5]改良的2型糖尿病模型建立方法，模型組給予高脂、高糖飲食飼養(yǎng)后，禁食12 h(不禁水)，應(yīng)用電子稱稱取大鼠體質(zhì)量，根據(jù)體質(zhì)量臨時(shí)配用所需1%鏈脲佐菌素 (溶于0.1 mol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，冰浴中新鮮配制)，并置于冰盒中避光保存，按30 mg/kg腹腔注射。每周斷尾取血測(cè)定一次非空腹血糖值，連續(xù)2次測(cè)量血糖值均>13.5 mmol/L定義為糖尿病模型成功。

1.2.2 糖尿病性腦內(nèi)微小病變大鼠造模方法 糖尿病大鼠造模成功后每月給予低血糖誘導(dǎo)2次[6]。采用胰島素腹腔注射誘導(dǎo)大鼠低血糖的方法，腹腔注射短效胰島素(生物合成人胰島素，諾和諾德公司，50 U/kg)。以微型血糖儀斷尾法測(cè)量血糖，并記錄所有大鼠腹腔注射胰島素后每隔30 min的血糖值，直至達(dá)到目標(biāo)血糖(2.0～2.64 mmol/L)。達(dá)到目標(biāo)血糖后30 min再次監(jiān)測(cè)血糖，并給予50%葡萄糖溶液5 ml皮下注射來終止低血糖，30 min后再次監(jiān)測(cè)血糖。繼續(xù)給予高脂、高糖飲食飼養(yǎng)。

1.3 頭顱MRI篩查 飼養(yǎng)至6月齡對(duì)大鼠進(jìn)行頭顱MRI檢查，以大鼠頭顱MRI的T2WI上發(fā)現(xiàn)腦內(nèi)微小病變≥6個(gè)而無腦梗死病灶出現(xiàn)定義為造模成功。MRI機(jī)器型號(hào)：3T imaging system (MAGNETOM Verio；Siemens Healthcare)。采用4通道相控大鼠線圈(Chenguang Medical Technologies Co，Ltd)，線圈型號(hào)：CG-MUC18-H300-AS。

1.4 腦組織準(zhǔn)備及組織病理學(xué)評(píng)價(jià) 給予大鼠腹腔注射10%水合氯醛，過量麻醉后處死，在無菌條件下取大鼠腦組織。切取厚度為2～3 mm腦組織，置于多聚甲醛中固定48 h，石蠟包埋。冠狀面連續(xù)切片(片厚4～7 μm)。

1.4.1 HE染色 石蠟切片脫臘后梯度乙醇水化，蘇木素染色5 min，伊紅染色1～2 min，二甲苯透明，中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察腦組織形態(tài)。

1.4.2 免疫組化 取石蠟切片進(jìn)行免疫組化檢測(cè)， 一抗為低氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)抗體(1∶100，Abcam)，4℃孵育 16 h，加入廣譜二抗，室溫放置 30 min，隨后 DAB 顯色及蘇木素染核，65℃烘箱烘干，二甲苯透明，中性樹膠封片，鏡下觀察HIF-1α陽性細(xì)胞數(shù)目。

2 結(jié)果

2.1 血糖水平比較 糖尿病大鼠模型造模成功后，繼續(xù)飼養(yǎng)至6月齡。至該時(shí)間截點(diǎn)模型組非空腹血糖水平為(20.75±3.42)mmol/L，正常對(duì)照組為(5.13±0.32)mmol/L，模型組較正常對(duì)照組明顯升高(t=-11.141，P<0.01)。

2.2 每10 g血紅蛋白吸光度 模型組為5.358 5±0.193 6，正常對(duì)照組為1.268 7±0.174 9，模型組顯著高于正常對(duì)照組(t=-38.392，P<0.01)。

2.3 腦內(nèi)微小病變數(shù)目 正常對(duì)照組及模型組均無腦梗死病灶。腦內(nèi)微小病變較集中的部位為基底節(jié)和大腦皮層。

模型組腦內(nèi)微小病變平均(10.00±2.76)個(gè)，最少6個(gè)，最多14個(gè)，6只大鼠腦內(nèi)微小病變個(gè)數(shù)均≥6個(gè)。正常對(duì)照組腦內(nèi)微小病變平均(2.33±1.37)個(gè)，最少0個(gè)，最多4個(gè)。模型組腦內(nèi)微小病變數(shù)目多于正常組(t=-6.104，P<0.01)，見圖1。

2.4 病理學(xué)改變 與正常對(duì)照組相比，模型組腦組織神經(jīng)元數(shù)目減少，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞增生并腫脹，部分有微出血(圖2，封3)。免疫組化顯示，模型組腦組織鏡下HIF-1α陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)為(2 324.47±255.15)個(gè)，正常對(duì)照組為(474.94±91.65)個(gè)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-663.45，P<0.01)，見圖3。

3 討論

一直以來，糖尿病作為腦卒中的危險(xiǎn)因素，以其特殊的卒中特點(diǎn)受到廣泛關(guān)注。糖尿病伴發(fā)或并發(fā)腦卒中的發(fā)病率是正常人的2～3倍，且發(fā)病年齡較非糖尿病人群提前5年左右。其中以缺血性卒中多見，主要表現(xiàn)為多發(fā)的腔隙性腦梗死[7-9]。

近年來，腦內(nèi)微小病變作為腦梗死的“預(yù)知因子”逐漸受到重視。在無癥狀的中老年人群及無腦梗死病史的人群中，腦內(nèi)直徑<3 mm的微小病變使其患腦梗死及腦梗死相關(guān)死亡的風(fēng)險(xiǎn)增加至少3倍[4]。其中基底節(jié)上部和皮質(zhì)下白質(zhì)的微小病變與糖尿病相關(guān)，糖尿病是腦卒中與腦內(nèi)微小病變的共同危險(xiǎn)因素[10]。因此，建立一種糖尿病性腦內(nèi)微小病變的動(dòng)物模型，為相關(guān)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究及今后的臨床研究打下基礎(chǔ)，是十分必要而可行的。

本研究發(fā)現(xiàn)，采用每月兩次低血糖法誘導(dǎo)，至糖尿病大鼠6月齡時(shí)可產(chǎn)生適用的糖尿病性腦內(nèi)微小病變模型，模型組造模后出現(xiàn)腦內(nèi)微小病變個(gè)數(shù)均≥6個(gè)，全部造模成功，提示在高血糖的基礎(chǔ)上，反復(fù)低血糖損傷，在腦內(nèi)微小病變的產(chǎn)生過程中起到了至關(guān)重要的作用。該過程中無大鼠死亡，是安全適用的造模方法。

造模成功后的病理結(jié)果顯示大鼠腦組織神經(jīng)元數(shù)目減少，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞增生并腫脹，部分存在微出血。免疫組化結(jié)果顯示，HIF-1α陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)明顯高于正常對(duì)照組，說明HIF-1α可能在糖尿病并發(fā)腦內(nèi)微小病變的發(fā)病過程中起著舉足輕重的作用。

既往研究顯示，HIF-1α是缺氧或某些氧化應(yīng)激狀態(tài)下產(chǎn)生的誘導(dǎo)低氧基因表達(dá)和修復(fù)細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的調(diào)節(jié)因子[11-13]。在低氧環(huán)境下，HIF-1α誘導(dǎo)多種目的基因的表達(dá)，包括血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、內(nèi)皮素1、促紅細(xì)胞生成素、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶、核因子-κB等超過100個(gè)下游基因的表達(dá)。這些基因編碼的蛋白參與了血管新生與重塑、神經(jīng)再生、葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)及酵解、紅細(xì)胞生成、氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)等多種病理生理過程。HIF-1α在腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的破壞過程中起重要作用，缺血、缺氧后，可見腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞腫脹，空泡形成，部分細(xì)胞線粒體腫脹或空泡化，自噬體增多，核糖體脫落，甚至細(xì)胞核染色質(zhì)固縮，最終導(dǎo)致血-腦屏障破壞[14]。

在高血糖基礎(chǔ)上的反復(fù)低血糖損傷可誘導(dǎo)HIF-1α表達(dá)水平增加，提示糖尿病繼發(fā)的缺氧和氧化應(yīng)激機(jī)制參與了糖尿病性腦內(nèi)微小病變的形成，在該基礎(chǔ)上進(jìn)一步發(fā)生了血-腦屏障破壞、血管損傷和重塑、神經(jīng)元死亡、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞增生等改變。

由于目前尚無糖尿病性腦內(nèi)微小病變大鼠的造模方法，本研究旨在為科研工作提供一種成功率較高的造模方法。本模型既可以用于研究糖尿病腦內(nèi)微小病變的病理生理改變，也可以用于探索繼發(fā)的腦實(shí)質(zhì)病變。HIF-1α信號(hào)通路為進(jìn)一步研究糖尿病性腦內(nèi)微小病變的發(fā)病機(jī)制及治療靶點(diǎn)提供了線索。然而，本研究也存在一定的局限性，所需的造模時(shí)間較長(zhǎng)，可重復(fù)性仍需進(jìn)一步探討。在此基礎(chǔ)上可進(jìn)一步開展相關(guān)靶點(diǎn)的藥物治療，起到預(yù)防或治療腦內(nèi)微小病變的目的，進(jìn)而預(yù)防腦卒中的發(fā)生。