孟丹,周娜,王鑫,王東偉,魏玲玲,郭穎瓊,趙三虎,*

(1.山西師范大學(xué) 化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院,山西 臨汾 041001;2.忻州師范學(xué)院 化學(xué)系,山西 忻州 034000)

0 引言

紅花又稱紅藍(lán)花、草紅花、刺紅花等,屬于菊科植物,主要生長(zhǎng)在中亞地區(qū),在我國(guó)集中分布于新疆、河南、四川等地[1]。紅花中含有豐富的藥理活性成分,至今已經(jīng)分離得到包括查爾酮、黃酮苷、生物堿及聚炔類等多種類型的化合物超過(guò) 104 種[2-4]。紅花中的黃酮類物質(zhì)被認(rèn)為是具有生物活性代表性的化學(xué)成分,其傳統(tǒng)提取方法主要有醇提法[5]、微波輔助法[6]及超聲輔助法等[7],這些方法由于提取效率低或?qū)μ崛≡O(shè)備要求高等原因,為其規(guī)?；a(chǎn)帶來(lái)很大的不便?；诖?研究紅花中黃酮類物質(zhì)的提取方法備受關(guān)注[8-9]。

離子液體(ILs)是一種由有機(jī)陽(yáng)離子和無(wú)機(jī)陰離子組成的低熔點(diǎn)熔融鹽[10]。由于其對(duì)有機(jī)、無(wú)機(jī)物具有良好的溶解性，低蒸氣壓以及低毒等特性,被認(rèn)為是一種傳統(tǒng)有機(jī)溶劑的綠色替代品[11-13]。本文根據(jù)文獻(xiàn)方法合成了6種吡啶類離子鹽,并將其水溶液作為萃取劑,在微波輔助作用下提取紅花中的脂溶性總黃酮。通過(guò)紫外分光光度法與單因素實(shí)驗(yàn)相結(jié)合的方法探究了影響提取效果的因素,以期發(fā)展一種快速提取紅花中脂溶性總黃酮的方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器、試劑與材料

UV-2550型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(日本島津公司),XH-200A型電腦微波固液相合成/萃取儀(北京祥鵠科技發(fā)展有限公司),Bruke AVANCE Ⅲ 600 MHz全數(shù)字化超導(dǎo)核磁共振譜儀(瑞士布魯克拜厄斯賓(Bruker Biospin)公司)。

槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品(中國(guó)預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院勞衛(wèi)所)、無(wú)水乙醇及其他試劑均為分析純。實(shí)驗(yàn)所用紅花產(chǎn)自新疆,干燥粉碎過(guò)40目篩后備用。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 離子鹽的合成

參照文獻(xiàn)方法[14],合成了6種吡啶類離子鹽:溴化1-乙基吡啶、溴化1-正丁基吡啶、溴化1-正己基吡啶、溴化1-正辛基吡啶、溴化1-正癸基吡啶、溴化1-正十二烷基吡啶。產(chǎn)品結(jié)構(gòu)經(jīng)1H NMR及13C NMR 光譜表征,結(jié)果如下:

溴化1-乙基吡啶:白色晶體,產(chǎn)率91%,熔點(diǎn)117℃;1H NMR(600 MHz,DMSO)δ 9.26(d,J=5.5 Hz,2H,N=CH-),8.65(t,J=7.8 Hz,1H,=CH-),8.21 (t,J=7.0 Hz,2H,=CH-),4.73(q,J=7.3 Hz,2H,=NCH2-),1.56(t,J=7.3 Hz,3H,-CH3);13C NMR (126 MHz,DMSO)δ136.49,123.51,122.22,48.71,35.75,31.23,29.40,28.86,28.79,25.46,22.04,13.88.

溴化1-正丁基吡啶:白色晶體,產(chǎn)率92%,熔點(diǎn)104℃;1H NMR(600 MHz,DMSO)δ 9.31(s,2H,N=CH-),8.65(s,1H,=CH-),8.20(s,2H,=CH-),4.87-4.51(m,2H,=NCH2-),1.90(s,2H,-CH2-),1.27(s,2H,-CH2-),0.91(s,3H,-CH3);13C NMR(126 MHz,DMSO)δ 145.50,144.77,128.04,60.19,32.70,18.66,13.30.

溴化1-正己基吡啶:白色晶體,產(chǎn)率89%,熔點(diǎn)45℃;1H NMR(600 MHz,DMSO)δ 9.23(d,J=5.5 Hz,2H,N=CH-),8.65(t,J=7.8 Hz,1H,=CH-),8.23-8.17(m,2H,=CH-),4.68(d,J=7.4 Hz,2H,=NCH2-),1.97-1.87(m,2H,-CH2-),1.28(s,6H,-(CH2)3-),0.86(d,J=6.7 Hz,3H,-CH3);13C NMR(126 MHz,DMSO)δ 145.98,145.26,128.55,61.28,31.18,31.01,25.48,22.31,14.28.

溴化1-正辛基吡啶:白色晶體,產(chǎn)率90%,熔點(diǎn)29℃;1H NMR(600 MHz,DMSO)δ 9.21(d,J=5.6 Hz,2H,N=CH-),8.65(t,J=7.8 Hz,1H,=CH-),8.23-8.16(m,2H,=CH-),4.67(t,J=7.5 Hz,2H,=NCH2-),2.03-1.86(m,2H,-CH2-),1.33-1.14(m,10H,-(CH2)5-),0.85(t,J=7.0 Hz,-CH3);13C NMR(126 MHz,DMSO)δ145.97,145.25,128.55,61.10,31.59,31.23,28.90,28.81,25.84,22.50,14.40.

溴化1-正癸基吡啶:無(wú)色油狀黏稠液體,產(chǎn)率87%;1H NMR(600 MHz,DMSO) δ 9.24(s,2H,N=CH-),8.65(d,J=1.0 Hz,1H,=CH-),8.19(d,J=13.4 Hz,2H,=CH-),4.67(t,J=10.4 Hz,2H,=NCH2-),1.94-1.85(m,2H,-CH2-),1.24(m,14H,-(CH2)7-),0.83(t,J=5.3 Hz,-CH3);13C NMR(126 MHz,DMSO)δ 145.97,145.26,128.47,61.06,31.73,31.25,29.34,29.26,29.11,28.87,25.84,22.55,14.40.

溴化1-正十二烷基吡啶:白色固體,產(chǎn)率85%,熔點(diǎn)74℃;1H NMR(600 MHz,DMSO)δ 9.24(s,2H,N=CH-),8.66(s,1H,=CH-),8.20(d,J=7.1 Hz,2H,=CH-),4.69(s,2H,=NCH2-),1.99-1.84 (m,2H,-CH2-),1.25 (d,J=19.8 Hz,18H,-(CH2)9-),0.85 (t,J=7.0 Hz,3H,-CH3);13C NMR(126 MHz,DMSO)δ 145.97,145.26,128.55,61.06,35.61,32.72,31.77,29.48,29.19,28.89,28.55,27.97,25.86,22.56,14.40.

1.2.2 微波輔助吡啶類離子鹽水溶液提取紅花活性成分

準(zhǔn)確稱取0.15 g研磨好的紅花粉末于雞心瓶中,加入20 mL 1 mol/L 離子鹽水溶液,在400 W,50℃的條件下微波萃取5 min,待樣液冷卻后,抽濾,將濾液轉(zhuǎn)移到50 mL容量瓶中,用少量離子鹽水溶液洗滌容器和殘?jiān)?與提取液合并,用離子鹽水溶液定容至刻度線。然后從容量瓶中取0.50 mL紅花提取樣液于10 mL比色管中,用離子鹽水溶液定容、搖勻,得到樣品溶液。在300～500 nm下對(duì)樣品進(jìn)行紫外檢測(cè),測(cè)其吸光度,計(jì)算總黃酮提取量。

1.2.3 傳統(tǒng)方法提取

準(zhǔn)確稱取0.15 g研磨好的紅花藥材粉末于雞心瓶中,然后加入20 mL體積分?jǐn)?shù)70% 乙醇,回流提取3 h。待提取液溫度降至室溫后,抽濾,將濾液轉(zhuǎn)移至50 mL的容量瓶中,用少量70%乙醇洗滌容器和提取后的殘?jiān)?將洗滌液與提取液合并,然后用70% 乙醇定容。從容量瓶中取0.50 mL紅花提取液,置于10 mL比色管中,然后用70% 乙醇定容,得樣品溶液。將樣品溶液進(jìn)行紫外檢測(cè),計(jì)算總黃酮的提取率。

1.2.4 提取溫度的確定

準(zhǔn)確稱取0.15 g研磨好的紅花粉末于雞心瓶中,加入20 mL 1 mol/L溴化1-癸基吡啶鹽水溶液,分別在400 W,40℃、50℃、60℃的條件下微波萃取5 min,待樣液冷卻后,抽濾,將濾液轉(zhuǎn)移到50 mL容量瓶中,然后再用少量的離子鹽水溶液洗滌雞心瓶和提取后的殘?jiān)?與提取液合并,用離子鹽水溶液定容。然后從容量瓶中吸取0.50 mL紅花提取樣液,置于10 mL比色管中,用離子鹽水溶液定容、搖勻,得樣品溶液。將樣液在300～500 nm下進(jìn)行紫外檢測(cè),測(cè)其吸光度,計(jì)算總黃酮提取量。

1.2.5 提取劑濃度的確定

準(zhǔn)確稱取0.15 g研磨好的紅花粉末于雞心瓶中,然后分別加入20 mL 0.5 mol/L、1 mol/L、2 mol/L的溴化1-癸基吡啶鹽離子鹽水溶液于上述雞心瓶中,在400 W、50℃的條件下微波萃取5 min,待樣液冷卻后,抽濾,將濾液轉(zhuǎn)移到50 mL容量瓶,用少量離子鹽水溶液洗滌雞心瓶和提取后的殘?jiān)?再與提取液合并,用離子鹽水溶液定容。然后從容量瓶中吸取0.5 mL紅花提取樣液,置于10 mL比色管中,用離子鹽水溶液定容、搖勻,得樣品溶液。在300～500 nm下對(duì)樣品溶液進(jìn)行紫外檢測(cè),測(cè)定其吸光度,計(jì)算總黃酮提取量。

1.2.6 DPPH抗氧化實(shí)驗(yàn)

首先用無(wú)水乙醇配制1×10-4mol/L DPPH溶液,在10 mL比色管中分別移入相同濃度的5.0 mL、5.5 mL、6.0 mL、6.5 mL、7.0 mL的黃酮提取液和Vc溶液,再加入3.0 mL DPPH溶液,定容。把比色管放在黑暗處,避光反應(yīng)30 min后在517 nm處測(cè)它的吸光度。按照下式計(jì)算清除率:

DPPH的清除率%=[A0-(A1-A2)]/A0×100

Fig.1 Standard curve of quercetin圖1 槲皮素標(biāo)準(zhǔn)曲線

式中:A0為未加黃酮溶液測(cè)定的吸光度值;A1為測(cè)定液的吸光度值;A2為無(wú)DPPH的溶液所測(cè)定的吸光度值。

2 結(jié)果與討論

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確稱取10 mg槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品,用適量無(wú)水乙醇完全溶解,將溶解后的溶液定容到50 mL容量瓶中,得0.2 mg/mL的槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品母液。分別移取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品母液于10 mL比色管中,用無(wú)水乙醇定容,用紫外分光光度計(jì)測(cè)其吸光度,得回歸方程:Y=72.86X-0.020 4(R2=0.998 8),槲皮素標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖1。

2.2 不同離子鹽水溶液提取紅花脂溶性總黃酮

表1 不同離子鹽水溶液提取效果比較

Fig.2 UV absorption of general flavone extracted by different ionic salts solution圖2 不同離子鹽水溶液提取紅花總黃酮的紫外吸收

在微波輔助下,用1 mol/L離子鹽水溶液作為提取劑,(不同離子鹽水溶液提取紅花總黃酮的紫外吸收如圖2所示。)與傳統(tǒng)乙醇提取法相比,提取率得到了顯著提升;6種烷基鏈長(zhǎng)短不同的溴化烷基吡啶類離子鹽水溶液都顯示了好的提取效果,其中離子鹽[C10Py]Br水溶液的提取率最高,提取率達(dá)1.98%,高于70%乙醇作為提取劑的0.3%。分析表1中數(shù)據(jù),6種烷基鏈長(zhǎng)短不同的溴化烷基吡啶類離子液體水溶液作為提取劑,雖然整體趨勢(shì)是提取率越來(lái)越高,但對(duì)提取率的影響呈之字形,當(dāng)用12個(gè)碳的烷基吡啶離子液體作為提取劑時(shí),提取率顯著降低。其原因可能是離子液體烷基鏈長(zhǎng)短的變化,影響了溶液的極性,進(jìn)一步影響黃酮的溶出性;另外烷基鏈長(zhǎng)短發(fā)生變化,離子液體的破壁能力也發(fā)生變化,二者共同作用,導(dǎo)致提取率呈之字形變化。

2.3 提取溫度的確定

表2 溫度對(duì)[C10Py]Br提取效果的影響

由于紅花中主要黃酮在溫度60℃以上不穩(wěn)定[15],所以設(shè)置提取溫度為40℃、50℃、60℃。由圖3和表2可知,溴化1-癸基吡啶鹽離子鹽水溶液作為提取劑時(shí),50℃為較優(yōu)溫度。

2.4 提取劑濃度的確定

表3 [C10Py]Br的濃度對(duì)提取效果的影響

由圖4和表3可知,50℃提取紅花總黃酮時(shí),[C10Py]Br濃度為1 mol/L時(shí)效果最好。

Fig.4 UV absorption of different [C10Py]Br concentration圖4 不同[C10Py]Br濃度提取下的紫外吸收

Fig.5 Effect of flavonoids on DPPH free radicals圖5 紅花黃酮對(duì)DPPH自由基的清除效果

2.5 DPPH抗氧化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示,在黃酮濃度為0.029 8～0.038 5mg/mL的范圍內(nèi),紅花中黃酮對(duì)DPPH清除能力隨著它濃度的增加而減小;黃酮濃度為0.038 5～0.042 0 mg/mL時(shí),黃酮對(duì)DPPH的清除能力隨其濃度的增大而增大。當(dāng)黃酮濃度為0.029 8 mg/mL時(shí),DPPH清除率最大,為98.78%,IC50為0.038 6 mg/mL。為了進(jìn)一步驗(yàn)證離子液體溶劑對(duì)清除DPPH的影響,進(jìn)一步做了有離子液體及無(wú)離子液體的Vc溶液對(duì)DPPH的清除實(shí)驗(yàn),未見(jiàn)離子液體對(duì)Vc溶液清除DPPH有明顯影響。雖然紅花中黃酮在濃度為0.032 8 mg/mL之后對(duì)DPPH清除能力沒(méi)有抗壞血酸的清除能力高,但紅花黃酮對(duì)DPPH還是有較強(qiáng)的清除效果。

3 結(jié)論

通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn),探究了吡啶類離子鹽水溶液作為提取劑用于紅花總黃酮的提取,發(fā)現(xiàn)離子鹽烷基鏈的長(zhǎng)短、離子鹽濃度及提取溫度對(duì)提取率都有較大的影響,濃度為1 mol/L的[C10Py]Br水溶液作為提取劑,在50℃、微波輔助作用下可有效提取紅花中的脂溶性總黃酮。與傳統(tǒng)乙醇提取法相比,該方法所用時(shí)間短、提取率高。離子液體對(duì)提取效果的增強(qiáng)可能是由于其良好的破壁能力及溶出性能,使紅花中脂溶性總黃酮溶出更多、更快。DPPH抗氧化實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明該方法提取的紅花總黃酮在低濃度時(shí)對(duì)DPPH有較強(qiáng)的清除能力。該方法選用了對(duì)環(huán)境友好的離子鹽作為提取劑,不僅高效、便捷,而且易于規(guī)模化,是一種可選擇的提取紅花總黃酮的方法。同時(shí),由于該方法所用時(shí)間短、黃酮溶出性高,可用于快速檢測(cè)紅花脂溶性總黃酮的含量,進(jìn)一步用于紅花品質(zhì)的鑒定。