魏 云 吳麗娟 丁高中 馮雨苗 孫 瀾

近年有研究發(fā)現(xiàn)，皮膚鱗狀細(xì)胞癌(cSCC)約占所有皮膚惡性腫瘤的20%，其中cSCC的確診例數(shù)以每年2.6%的比例逐年升高[1]。日光性角化病(AK)和鮑溫病(BD)分別被認(rèn)為是癌前病變、原位鱗癌，在臨床及組織病理上可能代表了 cSCC 在不同演進(jìn)階段的表現(xiàn)或進(jìn)展過程。本研究對(duì)AK、BD、cSCC中的Caveolin-1蛋白與Met蛋白表達(dá)情況及意義進(jìn)行闡述，探討二者在cSCC發(fā)生、發(fā)展過程中的可能作用，并且有可能為以后cSCC的靶向治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 一般材料 本研究共納入55例病例和12例腫瘤邊緣正常皮膚。其中正常皮膚12例，平均年齡(63.42±7.077)歲，男8例，女11例，AK 19 例，男8例，女11例，平均年齡(71.68±11.982)歲；BD 17例，男 5例，女12例，平均年齡(63.94±9.404)歲；cSCC 19例，男7例，女12例，平均年齡(79.16±8.681)歲。以上所有標(biāo)本來源于2010年1月至2016年12月南京醫(yī)科大學(xué)附屬蘇州醫(yī)院皮膚科臨床資料及蠟塊保存完整并且經(jīng)過本院病理科確診為上述三種疾病的病例(已經(jīng)剔除脫片、組織殘缺不全或折片的標(biāo)本，選取組織完整的標(biāo)本進(jìn)行觀察和分析)。本研究通過南京醫(yī)科大學(xué)附屬蘇州醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)進(jìn)行。

1.2 方法 采用免疫組化SP法檢測(cè)Caveolin-1與Met蛋白在腫瘤邊緣正常皮膚、AK、BD、cSCC中的表達(dá)情況。試劑一抗選用Abcam company兔抗人Caveolin-1抗體(1∶100)、 Cell Signaling Technology company兔抗人Met抗體(1∶50)；二抗選用北京中杉金橋公司SP免疫組化試劑盒。陰性對(duì)照：染色過程中用PBS緩沖液代替一抗。

1.3 結(jié)果判定 按陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比：≤5%，0分；6%～25%，1分；26%～50%，2分；>50%，3分。按細(xì)胞染色強(qiáng)度：無(wú)染色，0分；淺黃色，1分；黃色，2分；棕褐色，3分。根據(jù)陽(yáng)性部位，隨機(jī)選擇5個(gè)高倍視野，每個(gè)視野數(shù)100個(gè)細(xì)胞，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)中按陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比與細(xì)胞染色強(qiáng)度乘積。Caveolin-1：0～3分，陰性；4分，+；6分，++；9分，+++。Met：0～1分，陰性；2～3分，+；4-6分，++；9分，+++。評(píng)分由兩位病理醫(yī)師隨機(jī)雙盲法獨(dú)立進(jìn)行，結(jié)果的判斷標(biāo)準(zhǔn)通過查詢參考文獻(xiàn)獲得。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，等級(jí)資料采用Kruskal-wallis H秩和檢驗(yàn)，率比較采用卡方及Fisher確切概率法，相關(guān)性分析采用spearman等級(jí)分析方法，P<0.05被認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 Caveolin-1及Met在腫瘤邊緣正常皮膚中的表達(dá)情況 Caveolin-1表達(dá)于細(xì)胞的胞膜，Met表達(dá)于胞膜和胞質(zhì)，正常皮膚中可見在基底膜表達(dá)(圖1a,2a)。

2.2 Caveolin-1及Met在AK、BD、cSCC中的表達(dá)情況(圖1b～1d，圖2b～2d)

a：正常皮膚組織；b：AK；c：BD；d：cSCC

圖1Caveolin-1免疫組化染色(×200)

a：正常皮膚組織；b：AK；c：BD；d：cSCC

2.2.1 Caveolin-1在腫瘤邊緣正常皮膚、AK、BD、cSCC中陽(yáng)性率依次為16.7%(2/12)、36.8%(7/19)、52.9%(9/17)、78.9%(15/19)，可知Caveolin-1在四組之間呈現(xiàn)逐漸遞增的表達(dá)趨勢(shì)(表1)。四組間采用Kruskal-wallis H秩和檢驗(yàn)，P=0.000124，有顯著意義。組間陽(yáng)性率比較采用卡方檢驗(yàn)：cSCC組明顯高于正常皮膚組χ2=11.519，P=0.001,差異有顯著性。正常皮膚組與AK組、BD組χ2=1.453、3.932，Ps>0.05,無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。AK組與CSCC組χ2=6.909，P=0.009，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。BD與AK組、cSCC組比較，χ2=0.942、2.731，Ps>0.05,無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2.2 Met在腫瘤邊緣正常皮膚、AK、BD、cSCC中陽(yáng)性率依次為8.3%(1/12)、26.3%(5/19)、58.8%(10/17)、84.2%(16/19)，同樣可知Met在四組之間呈現(xiàn)逐漸遞增的表達(dá)趨勢(shì)(表2)。四組間采用Kruskal-wallis H秩和檢驗(yàn)，P=0.000013，有顯著意義。組間陽(yáng)性率比較采用卡方檢驗(yàn)：BD組和cSCC組明顯高于正常皮膚組χ2=7.617、17.098，P=0.009、0.000,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。正常皮膚組與AK組χ2=1.524，P>0.05,無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。AK組與BD組、cSCC組χ2=3.901、12.880，Ps<0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。BD組與cSCC組比較，χ2=2.882，P>0.05,無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 Caveolin-1蛋白在正常皮膚、AK、BD、cSCC中的表達(dá)

表2 Met蛋白在正常皮膚、AK、BD、cSCC組織中的表達(dá)

2.3 Caveolin-1與c-Met在皮膚鱗癌中表達(dá)的相關(guān)性 相關(guān)性分析結(jié)果顯示Spearman等級(jí)相關(guān)系數(shù)r=0.484,P=0.036,皮膚鱗癌組織中Caveolin-1與Met表達(dá)呈正相關(guān)(表3)。

表3 鱗癌中Caveolin-1和Met表達(dá)關(guān)系19例

3 討論

皮膚腫瘤的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多環(huán)節(jié)多因素的復(fù)雜過程。cSCC是白種人群中第二常見的惡性非黑素瘤皮膚癌[2]，暴露于紫外線輻射是最大的危險(xiǎn)因素。對(duì)于cSCC，AK及BD可作為其重要的癌前病變及原位癌階段，在臨床及組織病理上可能代表了cSCC在不同演進(jìn)階段的表現(xiàn)或進(jìn)展過程。以往研究顯示超過十年的AK 將有1%～10%發(fā)展為cSCC，年轉(zhuǎn)化率低于千分之一[3]，同時(shí)未經(jīng)治療的BD有3%～26%的病例發(fā)展為侵襲性cSCC[4]。因此探討這些疾病的相關(guān)性可能會(huì)有助于減少惡變發(fā)生。

3.1 Caveolin-1在AK、BD及cSCC中的表達(dá) Caveolin-1基因定位于人類染色體7q31.1-31.2，其結(jié)構(gòu)主要包括中央高度保守的疏水區(qū)和兩側(cè)可變的N端、C端區(qū)域，在細(xì)胞膜內(nèi)具有特殊的發(fā)夾樣結(jié)構(gòu)[5]。Caveolin-1在許多生理和病理活動(dòng)中都扮演著重要的角色，不僅僅與膽固醇運(yùn)輸、信號(hào)傳導(dǎo)等過程相關(guān)，也具有監(jiān)管許多信號(hào)通路的作用。這些通路有如表皮生長(zhǎng)因子受體，蛋白激酶C、G蛋白和Src家族酪氨酸激酶，同時(shí)這些通路的異常都可能誘發(fā)人類癌癥的發(fā)展[6]。既往腫瘤的研究中，包括結(jié)腸癌、乳腺癌、 宮頸癌、胰腺癌、肺腺癌等都發(fā)現(xiàn) Caveolin-1 的表達(dá)量是降低的，而相反在肺鱗癌、肝癌、食道癌、前列腺癌、膀胱癌中，Caveolin-1的表達(dá)卻是增高的，并隨著腫瘤的分化程度的下降和侵蝕能力的增強(qiáng)表達(dá)升高。這可能與腫瘤的來源和類型相關(guān)[7]。

本研究中發(fā)現(xiàn)在正常對(duì)照組中Caveolin-1表達(dá)于基底層細(xì)胞胞膜，在AK組、BD組、cSCC組表達(dá)率分別為36.8%、52.9%、78.9%，染色強(qiáng)度與惡性程度相關(guān)。推測(cè)Caveolin-1可能在AK、BD的侵襲進(jìn)展中起著作用。而Langlois等[8]觀察到在cSCC中Caveolin-1蛋白表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組正常皮膚細(xì)胞。此外Trimmer等[9]學(xué)者的研究認(rèn)為Caveolin-1過表達(dá)具有降低皮膚鱗癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力。而降低Caveolin-1的表達(dá)同時(shí)增加侵襲能力和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。他們的結(jié)果和我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相矛盾，并且具有爭(zhēng)議性的結(jié)果在國(guó)內(nèi)外多個(gè)研究中如宮頸鱗癌[10，11]、口腔鱗癌[12，13]也存在。我們考慮cSCC的病因和臨床表現(xiàn)復(fù)雜，目前研究表明紫外線照射、人乳頭瘤病毒感染、器官移植、化學(xué)制劑等因素均與cSCC的發(fā)病密切相關(guān)[1]。同時(shí)cSCC也常繼發(fā)于一些皮膚疾病的基礎(chǔ)上[14]，如光化性角化病、著色性干皮病、盤狀紅斑狼瘡、硬化萎縮性苔蘚、扁平苔蘚、尋常狼瘡、疣狀表皮發(fā)育不良、遺傳性大皰性表皮松解癥等。由此我們推測(cè)cSCC的異質(zhì)性可能是本研究結(jié)果與國(guó)外研究結(jié)果出現(xiàn)矛盾的原因。

3.2 c-Met在AK、BD及cSCC中的研究情況 原癌基因c-Met位于人類第7號(hào)染色體 7q21-q31,同時(shí)c-Met屬于酪氨酸激酶家族[15]。臨床和基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子與其受體c-Met結(jié)合并激活該受體的酪氨酸活性，可以引起酪氨酸的自身磷酸化[16]，活化多條下游信號(hào)通路，調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)、存活和遷移等功能。c-Met過表達(dá)在人類惡性腫瘤中被廣泛發(fā)現(xiàn)，包括甲狀腺癌、卵巢癌、胃癌、結(jié)直腸癌和肝癌等。

在皮膚病領(lǐng)域，對(duì)外陰鱗癌的研究表明[17]，VIN I，II經(jīng)過VINIII到VSCC ，c-Met表達(dá)量增加，說明c-Met表達(dá)與細(xì)胞分化程度有關(guān),過表達(dá)與外陰鱗狀細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)變有關(guān)。但對(duì)皮膚癌前病變及皮膚鱗狀細(xì)胞癌少有研究報(bào)道。

本研究結(jié)果顯示正常對(duì)照組中Met表達(dá)在基底層細(xì)胞的胞膜或胞漿中。在AK、BD、CSCC表達(dá)率分別為26.3%、58.8%、84.2%，表現(xiàn)為隨著疾病病變程度的加深，陽(yáng)性表達(dá)率也呈現(xiàn)增加趨勢(shì)，染色強(qiáng)度也逐漸加深。同樣，由此可推測(cè)Met在AK癌變，BD、cSCC的侵襲及進(jìn)展中起著促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖的作用。同時(shí)兩兩比較的結(jié)果顯示AK和BD之間有顯著差異，而AK與正常組、BD組與cSCC組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說明Met在日光性角化癌變?yōu)樵击[癌中起到非常重要作用。若通過下調(diào)Met的表達(dá)可能抑制日光性角化病進(jìn)展為鱗癌，可能為皮膚鱗癌的靶向治療提供新的靶點(diǎn)。

3.3 Caveolin-1與Met在cSCC中的表達(dá)相關(guān)性及意義 Korhan等[18]在關(guān)于肝癌的研究報(bào)道中指出，一方面HGF引發(fā)的c-Met激活導(dǎo)致Caveolin-1酪氨酸14的磷酸化和表達(dá)的同時(shí)上升。為了證實(shí)Caveolin-1磷酸化可由c-Met激活，他們使用c-Met受體激酶抑制劑SU11274，阻斷c-Met活化，同時(shí)抑制了Caveolin-1的磷酸化。結(jié)果表明Caveolin-1的磷酸化依賴c-Met激活。另一方面，研究發(fā)現(xiàn)Caveolin-1的異位表達(dá)加速了c-Met信號(hào)傳導(dǎo)，導(dǎo)致遷移，侵襲和分支形態(tài)發(fā)生增強(qiáng)。通過沉默Caveolin-1的表達(dá)降低了c-Met的表達(dá)和細(xì)胞的遷移及侵襲潛能。得出C-met和Caveolin-1相互激活在肝癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移、侵襲中起著重要的作用。本實(shí)驗(yàn)中Caveolin-1與Met在cSCC中表達(dá)呈正相關(guān)，我們推測(cè)在cSCC中，Caveolin-1與Met在鱗癌的發(fā)生、發(fā)展、浸潤(rùn)中起著相互促進(jìn)的作用。

綜上所述，對(duì)于AK、BD可能發(fā)展成cSCC過程中，我們推測(cè)Caveolin-1與Met有相互促進(jìn)、協(xié)調(diào)作用，促使cSCC發(fā)生。