李紅偉， 丁 夢， 石延榜， 鄭曉珂， 馮衛(wèi)生?

（1. 河南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院， 河南 鄭州 450046； 2. 呼吸疾病診療與新藥研發(fā)河南省協(xié)同創(chuàng)新中心， 河南鄭州 450046）

山茱萸始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》， 云其“味酸，平。 主心下邪氣， 寒熱； 溫中， 逐寒濕痹； 去三蟲。 久服輕身”； 2015 版《中國藥典》 規(guī)定， 本品為山茱萸科植物山茱萸Cornus officinalis Sieb. et Zucc. 的干燥成熟果肉[1］。 現(xiàn)代研究從山茱萸中分離并鑒定出大約300 個化合物， 以有機酸、 環(huán)烯醚萜類為主， 此外還有鞣質(zhì)、 多糖、 揮發(fā)油、 脂肪油等， 其中莫諾苷和馬錢子苷被廣泛研究。 藥理研究表明， 山茱萸及其單體具有肝臟、 腎臟、 心臟、 神經(jīng)保護， 以及抗糖尿病、 抗氧化、 抗腫瘤、 抗炎、抗衰老、 抗健忘、 抗骨質(zhì)疏松、 止痛、 免疫調(diào)節(jié)等作用[2］。

目前， 山茱萸臨床應(yīng)用以山萸肉和酒萸肉為主， 而 傳統(tǒng) 鹽炙 （ 《本草述》 ）、 清炒 （ 《局方》 ）、 麩炒（《總錄》 ）、 醋蒸（《河南規(guī)范》 ）、油炙（《本草述》 ） 等炮制方法已很少應(yīng)用， 但酒萸肉的炮制機理并不明確[3］。 《雷公炮炙論》 中提到“凡欲使山茱萸， 須去內(nèi)核。 ……緩火熬之方用。 ……能壯元氣， 秘精。 核能滑精”， 后世歷代醫(yī)藥學(xué)家多信守之， 但也不乏有醫(yī)藥大家提出質(zhì)疑， 如《新修本草》 指出“既干后， 皮甚薄， 當(dāng)合核為用也”， 而《普濟方》 出現(xiàn)了所載方去核、連核入藥并存局面， 目前臨床上仍以去核為主， 是否應(yīng)該如此依然是中醫(yī)藥工作者爭論的焦點[3-4］。山萸肉及其核中的脂溶性成分以油酸、 亞油酸為主[5-6］， 本研究以該類成分為指標(biāo)， 采用GC-MS 法分析8 種炮制方法對其組成和含有量的影響， 以期為其炮制機理研究提供依據(jù)。

1 材料

Agilent 7890／7000B 三重串聯(lián)四級桿氣質(zhì)聯(lián)用儀（美國安捷倫公司）； AB204-N 型電子天平（萬分之一， 杭州匯爾儀器有限公司）； Q250A3 型粉碎機（浙江松青五金廠）； N1100VWD 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海愛朗儀器有限公司）； JZT-2003 型天然氣灶[華潤燃氣投資（中國） 有限公司］。

山茱萸購自亳州市中藥材市場， 產(chǎn)地河南西峽， 經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)董誠明教授鑒定為山茱萸科植物山茱萸Cornus officinalis Sieb. et Zucc. 的干燥成熟果肉及核。

正己 烷 （色 譜 純， 批 號 20150307， 規(guī) 格500 mL， 含有量≥99.5%， 天津科密歐化學(xué)試劑有限公司）； 三氟化硼甲醇溶液（上海安譜實驗科技股份有限公司， 批號20160301， 規(guī)格100 mL， 含有量≥99.5%）； 其他試劑均為分析純。

清香米醋 （統(tǒng)萬珍極食品有限公司， 批號20160120， 500 mL， 含有量≥3.50 g／100 mL）； 黃酒 （ 紹 興 柯 橋 第 三 酒 廠， 批 號 20170105A，500 mL， 含有量≥14.5%）； 精制碘鹽（中鹽皓龍鹽化有限責(zé)任公司， 批號1403240102116438，500 g， 含有量≥99.10 g／100 g）； 羊脂油來自綿羊； 麥麩（五得利面粉集團新鄉(xiāng)面粉有限公司，批號2018032141214267404）。

2 方法

2.1 炮制品制備

2.1.1 清蒸 取凈山萸肉， 照清蒸法 （通則0213） 置蒸鍋內(nèi)， 先用武火， 待“圓氣” 后改用文火蒸至外表呈紫黑色， 熄火后燜過夜， 取出。 每100 kg 山萸肉， 加20 kg 清水。

2.1.2 鹽蒸 取凈山萸肉， 加鹽水（0.20 g／mL）拌勻， 悶潤， 置蒸鍋內(nèi)， 蒸至色紫黑， 取出[7］。每100 kg 山萸肉， 加2.0 kg 鹽。

2.1.3 酒蒸 取凈山萸肉， 照酒蒸法 （通則0213） 蒸至酒吸盡， 表面紫黑色， 取出。 每100 kg山萸肉， 加20 kg 黃酒。

2.1.4 醋蒸 取凈山萸肉， 照醋蒸法 （通則0213） 蒸至醋盡并呈紫黑色。 每100 kg 山萸肉，加24 kg 醋。

2.1.5 清炒 取凈山萸肉， 照單炒法 （通則0213） 置預(yù)熱炒鍋中， 用文火加熱翻炒至表面顏色加深， 并透出固有氣味。

2.1.6 麩炒 取凈山萸肉， 照麩炒法 （通則0213） 炒至表面顏色加深， 篩去麥麩（即拌炒麥麩）。 每100 kg 山萸肉， 用10 kg 麩皮。

2.1.7 油炙 取凈山萸肉， 照油炙法 （通則0213） 炒至油被吸盡， 表面油亮光澤， 取出。 每100 kg 山萸肉， 用20 kg 羊脂油。

2.1.8 鹽炙 取凈山萸肉， 加鹽水（0.20 g／mL）拌勻， 照鹽炙法（通則0213） 炒干。 每100 kg 山萸肉， 用2 kg 鹽。

2.1.9 山萸肉及核 取新鮮成熟的山茱萸， 曬至六成干， 去核， 分別得到山萸肉及核， 兩者晾曬至干。

2.1.10 清炒麥麩 按照 “2.1.6” 項下方法，取麥麩， 不加山萸肉， 炒至相同性狀。 以上炮制品于烘箱中60 ℃干燥， 取出， 置干燥器中放涼備用。

2.2 脂溶性成分提取和衍生化處理 取生品和“2.1” 項下各炮制品適量， 分別加入20 倍量乙醚溶液， 索氏回流提取法（45 ℃） 提取8 h， 得到脂溶性成分， 計算得率， 公式為y=×100%， 其中y 為脂溶性成分得率； a 為山萸肉及其炮制品， 以及核和輔料分別所提取的脂溶性成分質(zhì)量； b 為山萸肉及其炮制品， 以及核和輔料質(zhì)量， 炮制品折合為原藥材質(zhì)量。

取樣品0.15 g， 加入0.5 mol／L KOH 甲醇溶液4.0 mL， 65 ℃水浴皂化15 ～30 min， 冷卻后加入10%三氟化硼甲醇溶液5.0 mL， 65 ℃水浴2 min，冷卻后加入正己烷、 飽和NaCl 溶液各2.0 mL， 取上清液， 加入無水Na2SO4后， 過濾， 干燥。

2.3 GC-MS 分析

2.3.1 GC 條件 DB-5 型石英毛細管柱（30 m ×0.25 mm， 0.25 μm）、 DB-1701 型石英毛細管柱（60 m × 0.25 mm， 0.25 μm）； 載氣為高純氦氣（含有量99.999%）； 體積流量1.0 mL／min； 進樣口溫度240 ℃； 不分流， 進樣量0.1 μL； 升溫程序為80 ℃保持1 min， 10 ℃／min 升至190 ℃，20 ℃／min 升至230 ℃， 保持5 min； 氣化室溫度280 ℃； 接口溫度280 ℃。

2.3.2 MS 條件 碰撞氣氦氣； 體積流量2.0 mL／min； 氮氣體積流量1.5 mL／min； 離子源為電子轟擊源， 電子能量70 eV； 掃描范圍m／z 45～600； 四級桿溫度150 ℃； 離子源溫度230 ℃；溶劑延遲4.5 min； GC-MS 接口溫度240 ℃。

2.3.3 MS 檢索和定量測定 應(yīng)用NIST14 系統(tǒng)譜庫自動檢索組分質(zhì)譜， 結(jié)合有關(guān)文獻， 分別與八峰索引和EPA／NIH 對照， 匹配度均在70%以上。 化合物的定量測定采用HewlettPackard 軟件， 按峰面積歸一化法計算其相對含有量。 見表1。

表1 各炮制品中脂溶性成分的組成和含有量Tab.1 Compositions and contents of liposoluble constituents in various processed products

續(xù)表1

3 結(jié)果

3.1 GC-MS 分析 山萸肉生品脂溶性成分總離子流圖見圖1。

圖1 生品脂溶性成分總離子流圖Fig.1 Total ion current chromatogram of liposoluble constituents in raw product

3.2 組成和含有量分析

3.2.1 脂溶性成分 表2 顯示， 山萸肉的各炮制方法均能提高脂溶性成分的提取率， 依次為油炙＞麩炒＞鹽炙＞清炒＞鹽蒸＞清蒸＞醋蒸＞酒蒸＞生品；與生品相比， 脂溶性成分種類以清蒸、 鹽蒸、 麩炒、 鹽炙、 油炙品減少， 而酒蒸、 醋蒸、 清炒品增加， 含有量均為100%； 山萸肉各炮制品中各成分含有量在99.00% 以上； 所得脂溶性成分均以飽和、 不飽和脂肪酸為主， 總含有量可達90.00%以上； 對于不飽和脂肪酸， 清蒸、 酒蒸、 鹽蒸、 清炒、 油炙、 鹽炙品含有量與生品相比均降低， 而醋蒸、 麩炒品均升高； 對于飽和脂肪酸， 除山萸肉醋蒸、 麩炒品含有量降低外， 其余相對于生品均升高； 核脂溶性成分提取率比山萸肉高， 不飽和脂肪酸含有量達90.20%， 主成分亞油酸、 11-油酸。 在各炮制品脂溶性成分中， 含有量大于5.00% 的有肉豆蔻酸、 軟脂酸、 硬脂酸、 11-油酸、 亞油酸、木焦油酸， 見表1。

表2 不同炮制品中脂溶性成分的分析結(jié)果Tab.2 Analysis results of liposoluble constituents in various processed products

樣品 提取率／% 檢出成分／種（含有量／%）鑒定成分／種（含有量／%）不飽和脂肪酸／種（含有量／%）飽和脂肪酸／種（含有量／%）生品 1.40±0.20 47（100.00） 38（99.47） 7（51.77） 22（45.50）清蒸 1.63±0.40 46（100.00） 37（99.13） 6（48.94） 23（47.53）鹽蒸 1.69±0.52 45（100.00） 41（99.29） 7（36.14） 24（58.94）酒蒸 1.51±0.26 52（100.00） 42（99.15） 8（29.89） 22（62.92）醋蒸 1.59±0.30 60（100.00） 44（99.09） 10（75.01） 24（22.93）清炒 2.11±0.61 54（100.00） 46（99.91） 9（43.23） 27（54.23）麩炒 2.88±0.53 44（100.00） 38（99.79） 9（77.52） 22（21.99）油炙 16.56±0.52 43（100.00） 38（99.84） 11（45.09） 24（54.65）鹽炙 2.33±0.66 43（100.00） 34（98.90） 7（35.83） 20（58.70）核6.29±0.76 35（100.00） 23（99.77） 11（90.20） 10（9.53）羊脂油 - 36（100.00） 36（100.00） 13（45.53） 23（54.47）麥麩 0.85±0.13 40（100.00） 15（93.95） 5（73.53） 6（19.98）炒麥麩 0.62±0.10 41（100.00） 17（94.41） 7（75.09） 8（18.42）拌炒麥麩 0.82±0.21 29（100.00） 23（99.24） 9（77.63） 12（20.68）

相對于生品， 清炒、 拌炒麥麩中脂溶性成分提取率呈降低趨勢， 所含的不飽和脂肪酸相對含有量呈升高趨勢； 對于飽和脂肪酸， 清炒麥麩相對含有量呈降低趨勢， 而拌炒麥麩呈升高趨勢。 羊脂油生品檢測結(jié)果表明， 其飽和脂肪酸含有量相對不飽和脂肪酸含有量高[8］。

3.2.2 獨有成分和共有成分 獨有成分和共有成分反映了山茱萸經(jīng)過不同的炮制工藝后， 其所含脂溶性成分發(fā)生了化學(xué)結(jié)構(gòu)改變， 產(chǎn)生了新成分； 共有成分反映了不同炮制品的相似程度及共同含有的脂溶性成分。 見表3。

表3 各樣品脂肪酸的比較Tab.3 Comparison of fatty acids among various samples

4 討論

山萸肉不同炮制品中用到了多種輔料， 如黃酒、 米醋等， 文獻報道它們在規(guī)定用量下未檢測出脂溶性成分， 故本實驗排除了輔料干擾[9］。 在相同GC-MS 條件下對輔料麥麩（麥麩、 清炒麥麩、拌炒麥麩） 和羊脂油進行檢測， 由表2 可以看出，麥麩清炒后脂溶性成分提取率均降低， 但拌炒麥麩升高， 表明它吸附了山萸肉受熱滲出的脂溶性成分， 這與文獻報道麥麩可以吸附飲片中的脂溶性成分一致[10］。 與清炒山萸肉相比， 麩炒山萸肉中脂溶性成分提取率有所升高， 同時兩者在拌炒過程中滲出的脂溶性成分互相浸潤[10］。 通過表3 中山萸肉生品、 清炒品、 油炙品與羊脂油炙品中的脂溶性成分比較， 可知羊脂油中部分成分可能滲入進山萸肉中， 同時也產(chǎn)生了（9E， 12E） -亞油酸甲酯等新成分。

2015 年版《中國藥典》 收錄山茱萸的炮制品有山萸肉和酒萸肉， 均具有補益肝腎、 收澀固脫的功效。 用于眩暈耳鳴、 腰膝酸痛、 陽痿遺精、 遺尿尿頻、 崩漏帶下、 大汗虛脫、 內(nèi)熱消渴等癥[1］。酒蒸、 清蒸山萸肉可降低其酸性， 增強其補肝腎作用； 醋蒸山萸肉增強其收斂澀精作用； 麩炒山萸肉最早出自《總錄》 蓽澄茄飲方， 用于脾臟久虛、積冷不散及陰氣傷寒、 喘悶堅脹、 四肢厥逆； 油炙、 鹽炙山萸肉最早記載于《本草述》 中， 其中油炙山萸肉見于加減地黃丸， 用于治療男子天元受傷、 精氣耗損、 胃虛勞熱、 骨體空虛、 腎臟不足、陽痿不舉、 精泄不施、 或因孕而不育， 久服百病能瘥、 精神倍增、 陽生陰長， 有生生廣嗣之妙而鹽炙山萸肉是與補骨脂、 五味子、 人參、 鹽共炒之， 用于治療小便頻數(shù)淋瀝。

山萸肉8 種炮制品及其核中的脂溶性成分均以游離脂肪酸為主， 現(xiàn)代研究表明， 人體攝入過多飽和脂肪酸會產(chǎn)生脂毒性， 誘導(dǎo)細胞凋亡， 引發(fā)多種疾病， 如胰島β-細胞受損， 胰島素抵抗， 促使2型糖尿病的發(fā)生和發(fā)展， 引起肝臟疾病、 動脈粥樣硬化和冠心病等。 山萸肉及其8 種炮制品中主要含有軟脂酸、 硬脂酸、 肉豆蔻酸、 木焦油酸等飽和脂肪酸[11-14］， 而且所含的不飽和脂肪酸對以上成分所引發(fā)的機體損傷還具有保護作用， 這也可能是臨床上山茱萸不同炮制品大多用于補肝腎方劑中的物質(zhì)基礎(chǔ)， 它們以亞油酸、 油酸為主， 不同炮制品中兩者含有量之和在31% ～70%范圍內(nèi)， 其中亞油酸是人體無法自身合成的必須不飽和脂肪酸， 全部靠食物攝取[15-16］。 此外， 除清蒸和清炒外， 山萸肉其余6 種炮制品均產(chǎn)生新成分（13Z） -二十二碳烯酸， 該成分通過降低患者血漿中非分枝長鏈脂肪酸（VLCFA C26∶0） 的異常積累， 對X 連鎖隱性遺傳病—腎上腺腦白質(zhì)營養(yǎng)不良有治療作用， 并且可預(yù)防輕度男孩患者神經(jīng)髓鞘脫失癥狀[17］， 這與《小兒藥證直訣》 中錢乙用六味地黃丸治療兒童“腎怯失音， 囪門不合， 神不足， 目中白睛多” 癥相似， 表明在治療X 連鎖隱性遺傳病—腎上腺腦白質(zhì)營養(yǎng)不良疾病方面， 山萸肉需要炮制入藥。

本實驗通過對山萸肉不同炮制品中脂溶性成分的分析， 以提取率和不飽和脂肪酸含有量為指標(biāo)，結(jié)果表明除醋蒸和麩炒法以外， 其他炮制方法均呈降低趨勢， 包括凈制去核。 通過查閱中國方劑數(shù)據(jù)庫和方劑現(xiàn)代應(yīng)用數(shù)據(jù)庫， 以“山茱萸” 為主題詞檢索， 發(fā)現(xiàn)山茱萸無論是在傳統(tǒng)應(yīng)用和現(xiàn)代臨床應(yīng)用中均以山萸肉生品為主（檢索得到方劑1 377個， 以生品入藥1 243 個， 占90.27%）， 故不同炮制品藥效學(xué)及臨床功效的差異性值得深入研究， 以便于臨床辨證施藥。