張 威， 劉玉梅， 呂秉鼎， 劉峻麟， 朱月健， 曹 勇， 韓榮春， 俞年軍?

（1. 安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院， 安徽 合肥 230012； 2. 安徽普仁中藥飲片有限公司， 安徽 亳州 236800；3. 安徽濟(jì)人藥業(yè)有限公司， 安徽 亳州 236800）

柴胡為我國常用中藥， 原名茈胡， 始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》， 列為上品， 《本草綱目》 中記載“茈胡生山中， 嫩則可茹， 老則采而為柴”， 故其苗有茹草之名， 其根有柴胡之名。 2015 年版《中國藥典》 中記載， 柴胡為傘形科植物柴胡Bupleurum chinense DC. 或狹葉柴胡Bupleurum scorzonerifolium Willd. 的干燥根， 有“北柴胡” 和“南柴胡”之分[1］， 具有解熱、 抗病毒、 降血脂、 保肝、 抗炎、 抗腫瘤等作用[2-4］， 主要分布于華北、 東北、 華東、 華中一帶，資源量較大。 柴胡為我國傳統(tǒng)大宗中藥材， 隨著國家對(duì)中醫(yī)藥的保護(hù)， 其用量日益增加， 野生資源遭到嚴(yán)重破壞，較上世紀(jì)70 年代下降約1／2[5］， 當(dāng)前市場(chǎng)流通以栽培品為主。 柴胡化學(xué)成分復(fù)雜， 含有皂苷、 黃酮、 揮發(fā)油、 多糖等多種成分[6-8］， 不同產(chǎn)地、 生長方式、 采收加工方式等可使其有效成分含有量有所差異[9-10］， 導(dǎo)致質(zhì)量難以有效控制， 僅以藥典規(guī)定的柴胡皂苷a、 d 的含有量作為指標(biāo)不足以全面評(píng)價(jià)其質(zhì)量優(yōu)劣[11-14］， 而中藥指紋圖譜能從整體上分析， 可為該中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)提供依據(jù)[15］。

秦嶺山脈西起甘肅南部， 經(jīng)陜西南部、 山西南部， 東至河南西部， 被認(rèn)為是柴胡的主產(chǎn)區(qū)， 本草記載柴胡“以銀州者為勝”， 則說明了秦嶺地區(qū)柴胡的道地性。 秦嶺地區(qū)作為柴胡道地產(chǎn)區(qū)及主產(chǎn)區(qū)， 目前研究較少， 且對(duì)柴胡指紋圖譜的研究局限于不同品種及產(chǎn)地， 對(duì)不同生長方式間指紋圖譜研究相對(duì)較少[16-19］。 前期對(duì)甘肅、 陜西、 山西調(diào)研發(fā)現(xiàn)， 3 個(gè)省均具有較大規(guī)模的北柴胡種植， 栽培品大多采用野生種栽培， 且發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地之間存在相互引種的現(xiàn)象， 因此本實(shí)驗(yàn)針對(duì)秦嶺地區(qū)不同產(chǎn)地及不同生長方式的北柴胡進(jìn)行指紋圖譜研究， 以探究其質(zhì)量差異性。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Agilent 1260 Infinity Ⅱ液相色譜儀， 配置G7111A 四元泵、 G7129A 自動(dòng)進(jìn)樣器、 G7114A 紫外檢測(cè)器（美國Agilent 公司）； CP225D 型電子天平（十萬分之一，德國Sartorius 公司）； HH-4 型數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇市晶玻實(shí)驗(yàn)儀器廠）； AS 系列超聲清洗機(jī)（天津奧特賽恩斯儀器有限公司）； 竑力HL-200A 型高速多功能打粉機(jī)（上海賽耐機(jī)械有限公司）； Cascada III. I 10 型純化水系統(tǒng)（頗爾過濾器（北京） 有限公司）。

1.2 試劑 柴胡皂苷a （批號(hào)DST180210-006， 含有量≥98%）、 柴胡皂苷c （DST170330-007， 含有量≥99%）、 柴胡皂苷d （批號(hào)DST170801-008， 含有量≥98%） 對(duì)照品均購于成都德思特生物技術(shù)有限公司。 乙腈 （批號(hào)AC-10841124， 色譜純）、 甲醇（批號(hào)Me-00040203， 色譜純）購于瑞典Oceanpak 公司； 純化水（自制）； 磷酸（天津永大化學(xué)試劑有限公司， 色譜純）； 氨水等其余試劑均為分析純。

1.3 藥材 北柴胡采自甘肅、 陜西、 山西， 信息見表1，經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院俞年軍教授鑒定為正品。

2 方法和結(jié)果

2.1 色譜條件 Topsil HPLC C18色譜柱 （250 mm×4.6 mm， 5 μm）； 流動(dòng)相乙腈（A） -0.1% 磷酸（B）， 梯度洗脫（0～5 min， 15% ～25% A； 5 ～40 min， 25% ～55%A； 40～55 min； 55% ～60% A； 55～65 min， 60% ～75% A；65～75 min， 75% ～85% A； 75～85 min， 85% ～90% A）； 柱溫30 ℃； 體積流量1.0 mL／min； 檢測(cè)波長210 nm； 進(jìn)樣量20 μL。

2.2 溶液制備

2.2.1 對(duì)照品溶液 精密稱取柴胡皂苷a 1.87 mg、 柴胡皂苷c 0.76 mg、 柴胡皂苷d 1.28 mg， 置2 mL 棕色量瓶中， 甲醇溶解， 定容， 搖勻， 即得， 過濾備用。

表1 樣品信息

2.2.2 供試品溶液 取藥材粉末（過4 號(hào)篩） 約0.5 g，精密稱定， 置具塞錐形瓶中， 加入含5% 濃氨試液的甲醇25 mL， 密塞， 30 ℃超聲 （功率200 W、 頻率40 kHz）30 min， 過濾， 用20 mL 甲醇分2 次洗滌容器及藥渣， 洗液與濾液合并， 水浴揮干， 殘?jiān)蛹状既芙猓?轉(zhuǎn)移至5 mL量瓶中， 加甲醇至刻度， 搖勻， 過濾， 取續(xù)濾液， 即得。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度試驗(yàn) 取樣品S1， 按“2.2.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液， 在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6 次， 記錄液相色譜圖， 測(cè)得各共有峰相對(duì)保留時(shí)間、 相對(duì)峰面積RSD 均分別小于0.65%、 1.91%， 表明儀器精密度良好。

2.3.2 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱定同一批藥材粉末6 份， 按“2.2.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液， 在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定， 記錄液相色譜圖， 測(cè)得各共有峰相對(duì)保留時(shí)間、 相對(duì)峰面積RSD 均分別小于0.93%、 2.55%， 表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液， 在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下于0、 2、 4、 6、 8、 12 h 進(jìn)樣測(cè)定， 記錄液相色譜圖， 測(cè)得各共有峰相對(duì)保留時(shí)間、 相對(duì)峰面積RSD 均分別小于1.21%、 2.87%， 表明溶液在12 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4 指紋圖譜建立 取藥材粉末（過4 號(hào)篩）， 精密稱定，按“2.2.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液， 在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定， 記錄液相色譜圖。

2.4.1 共有峰確認(rèn) 將24 批樣品色譜圖AIA 文件導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2004 版）， 進(jìn)行共有峰數(shù)據(jù)處理， 設(shè)置S1 為參照指紋圖譜， 多點(diǎn)校正匹配， 得到24 批樣品HPLC 指紋圖譜和色譜圖， 見圖1 ～2。 共標(biāo)定出12 個(gè)共有峰， 其中2 號(hào)峰為柴胡皂苷c， 4 號(hào)峰為柴胡皂苷a， 7 號(hào)峰為柴胡皂苷d， 由于4 號(hào)峰峰面積較大， 分離度較好， 故選擇其作為參照峰， 各共有峰相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積見表2～3。

圖1 24 批樣品HPLC 指紋圖譜

表2 24 批樣品共有峰相對(duì)保留時(shí)間

表3 24 批樣品共有峰相對(duì)峰面積

圖2 各樣品HPLC 色譜圖

2.4.2 相似度分析 將24 批樣品色譜圖AIA 文件導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2004 版）， 進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)， 見表4。 可知24 批樣品與參照?qǐng)D譜比較， 相似度均在0.920～0.989 之間， 表明不同產(chǎn)地、 生長方式樣品的質(zhì)量相對(duì)穩(wěn)定。

表4 24 批樣品相似度

2.4.3 聚類分析 將24 批樣品的12 個(gè)共有峰峰面積數(shù)據(jù)導(dǎo)入SPSS 23.0 軟件進(jìn)行聚類分析， 以平方歐式距離為各樣品間相似度距離， 采用質(zhì)心聚類的方法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，見圖3。 24 批樣品被分為2 大類， 其中S2 ～S4、 S6、 S9 ～S10、 S13、 S18 聚為一類， 其他樣品聚為一類； S1 ～S3 為山西省野生品， S4～S8 為山西省栽培品， S9～S12 為陜西省野生品， S13～S16 為陜西省栽培品， S17 ～S21 為甘肅省野生品種， S22～S24 為甘肅省栽培品種， 表明不同產(chǎn)地、 不同生長方式間北柴胡樣品質(zhì)量較近， 推測(cè)可能與栽培品多采用野生種種植有關(guān)。

圖3 24 批樣品聚類樹狀圖

2.4.4 主成分分析 對(duì)12 個(gè)共有峰進(jìn)行主成分分析， 將數(shù)據(jù)導(dǎo)入SPSS 23.0 軟件， 得出各共有峰方差貢獻(xiàn)表， 見表5。 12 個(gè)共有峰中得到4 種主成分， 第一主成分貢獻(xiàn)率為42.209%， 第二主成分貢獻(xiàn)率為24.701%， 第三主成分貢獻(xiàn)率為13.195%， 第四主成分貢獻(xiàn)率為8.349%， 4 種主成分累積貢獻(xiàn)率達(dá)88.453%， 即該4 種主成分能反映藥材基本信息。 將共有峰面積數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA 14.1 軟件進(jìn)行主成分分析， 結(jié)果見圖4， 顯示4、 7、 10、 12 號(hào)峰得分較高，與表5 結(jié)果一致， 4 種主成分為4、 7、 10、 12 號(hào)峰， 其中4 號(hào)峰為柴胡皂苷a， 7 號(hào)峰為柴胡皂苷d， 10 號(hào)峰與12 號(hào)峰未知。 圖5 顯示， 樣品S3、 S6、 S9、 S10、 S13、 S18 為一類， 其他為一類， 與聚類分析結(jié)果基本一致。

表5 共有峰總方差

圖4 24 批樣品共有峰得分圖

圖5 24 批樣品PCA 得分圖

3 討論與結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)對(duì)不同流動(dòng)相（甲醇-水、 甲醇-0.1%磷酸、 乙腈-水、 乙腈-0.1% 磷酸） 進(jìn)行考察， 發(fā)現(xiàn)以乙腈-0.1% 磷酸洗脫時(shí)， 色譜圖分離度及峰形較好， 故以其為流動(dòng)相。同時(shí)， 檢測(cè)波長選擇2015 年版《中國藥典》 中的210 nm。

本實(shí)驗(yàn)確定了12 個(gè)共有峰， 經(jīng)對(duì)照品指認(rèn)， 2 號(hào)峰為柴胡皂苷c， 4 號(hào)峰為柴胡皂苷a， 7 號(hào)峰為柴胡皂苷d。 主成分分析顯示， 共有峰中4 個(gè)主成分方差累積貢獻(xiàn)率達(dá)到88.453%， 分別為4 號(hào)峰、 7 號(hào)峰、 10 號(hào)峰（未知）、 12 號(hào)峰（未知）， 從一定程度上說明了《中國藥典》 以柴胡皂苷a、 d 作為質(zhì)量評(píng)價(jià)依據(jù)的合理性； 相似度分析顯示， 24批樣品與參照?qǐng)D譜的相似度均在0.920～0.989 之間， 表明各批藥材質(zhì)量相對(duì)穩(wěn)定； 聚類分析結(jié)果分為2 大類， S2、S3、 S4、 S6、 S9、 S10、 S13、 S18 聚為一類， 其他樣品聚為一類。 24 批不同產(chǎn)地、 生長方式下北柴胡的質(zhì)量較穩(wěn)定，栽培品與野生品可聚為一類， 一定程度上前者可替代后者，為野生轉(zhuǎn)家種的推廣提供參考。