李 牧，李東朋，宋 迪，趙成斌，岳賽超，馮 杰，楊 波，關方霞

1)鄭州大學第一附屬醫(yī)院神經外科 鄭州 450052 2)北京回龍觀醫(yī)院精神科 北京 102200

面神經為周圍神經重要的一支，由于其結構和位置的特殊性，在外傷、手術、炎癥或腫瘤等情況下較易受到損傷，可引起部分或完全性面癱，嚴重影響面部美觀、功能及生活質量[1]。面神經損傷的藥物及手術治療效果欠佳，神經功能恢復難以達到損傷前的水平，因此尋找有效的治療方法尤為重要。沃頓膠富含具有多向分化及神經修復潛能的細胞，具有改善損傷局部微環(huán)境和神經修復的作用[2]。本研究采用人臍帶沃頓膠薄片治療面神經損傷模型大鼠，觀察髓鞘修復效果及電生理變化，測定損傷局部髓鞘蛋白及細胞因子的表達分布，探討可能的分子機制，為人臍帶沃頓膠薄片修復面神經損傷奠定實驗基礎。

1 材料與方法

1.1實驗動物、主要試劑及儀器選用健康成年雌性Wistar大鼠64只，體重180～210 g，購自河南省實驗動物中心[動物合格證號：SCXK(豫)2010-0002]。飼養(yǎng)條件符合清潔級標準，環(huán)境溫度控制在22～24 ℃。HE染色試劑盒購于北京博奧森公司，髓鞘堿性蛋白(myelin basic protein,MBP)、 腦源性神經營養(yǎng)因子(brain derived neurotrophic factor,BDNF)及神經生長因子(nerve growth factor,NGF)購于武漢博士德公司，ELISA試劑盒購自美國TSZ Biosciences公司。肌電圖誘發(fā)電位記錄儀[Keypoint 4(33A04)，Denmark公司]，電鏡(SMZ1000，尼康公司)。

1.2沃頓膠薄片制作人臍帶由鄭州大學第一附屬醫(yī)院產科提供,捐贈者均簽署知情同意書，經檢測傳染性相關指標均呈陰性后用于本實驗。剝離臍帶外膜并分離去除動靜脈后即為沃頓膠組織，剪成 5 mm3大小組織塊，置于培養(yǎng)皿中，加入5 mL無血清DMEM/F12培養(yǎng)基，于37 ℃、體積分數(shù)5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當在顯微鏡下觀察到培養(yǎng)皿中組織塊有間充質細胞長出時，說明沃頓膠組織已有活性。取出沃頓膠組織塊，采用細胞切片機將組織塊制成5 mm2大小，厚度50 μm的薄片備用。

1.3實驗分組及模型制作實驗前仔細觀察大鼠面部，評估面神經功能，確認觸須活動無異常、面部對稱、瞬目反射無異常。采用隨機數(shù)字表法將64只大鼠分為3組，假手術組(n=14)，模型組(n=25)，沃頓膠薄片組(n=25)。所有大鼠用鹽酸氯胺酮(0.2 mL/kg)腹腔內注射麻醉并維持體溫，固定頭顱，耳前后常規(guī)剃毛備皮消毒，于大鼠耳后橫行切口，逐層切開皮膚，暴露顳肌表面面神經，沿面神經分支逐步尋至面神經莖乳孔出口，剝離莖乳孔后方附著于顱骨上的顳肌，暴露莖乳孔后方顱骨，以磨鉆緩慢仔細磨開顱骨，直徑約 5 mm，暴露面神經顱內段主干。假手術組只暴露面神經主干，模型組以無損傷血管鉗鉗夾20 s，沃頓膠薄片組先鉗夾20 s，再將沃頓膠組織塊貼敷于損傷的神經處，依次縫合肌肉和皮膚。模型制作中無大鼠死亡。

1.4大鼠面神經功能評估分別在造模后第 1、3、10、20、30天測試瞬目反射、觸須活動，觀察鼻尖位置，并進行評分。①瞬目反射中雙側眼瞼閉合無明顯差異為0分，患側眼瞼閉合反應較對側延遲為1分，患側眼瞼無法閉合為2分。②雙側觸須活動靈敏、對稱、無明顯差異為0分，患側觸須活動較對側明顯減弱但仍有觸須活動為1分，患側觸須活動完全消失為2分。③鼻尖位置居中為0分，鼻尖歪斜、偏向對側為1 分[3]。

1.5電生理檢查造模后第30天，采用肌電圖誘發(fā)電位記錄儀，在電磁屏蔽室內進行電生理檢測(雙側同時檢測)。大鼠腹腔內注射鹽酸氯胺酮(0.2 mL/kg)麻醉，取俯臥位，固定頭部及四肢。刺激電極和記錄電極均采用同心圓針型雙極電極。刺激電極置入面神經出莖乳孔處皮下，記錄電極置于記錄側觸須墊肌肉中，接地電極置于鼠尾。采用波寬為0.2 ms，頻率為1 Hz的方波脈沖電流，連續(xù)同強度刺激誘發(fā)復合肌肉動作電位，測量并記錄M 波潛伏期和波幅。每只大鼠測試2次，間隔10 min，取2次測試的平均值。測試完成后處死大鼠，取鉗夾損傷段面神經主干，用于以下檢測。

1.6面神經組織病理學觀察取面神經主干，置于體積分數(shù)10%的甲醛溶液中固定3 d，作冠狀位石蠟切片，片厚4 μm，HE染色，常規(guī)脫水，中性樹膠封片。光鏡(×200)下觀察。

1.7透射電鏡觀察超微結構取面神經主干，PBS沖洗后，切成小組織塊，迅速加入體積分數(shù)為2.5%戊二醛固定液，4 ℃避光保存。48 h后加體積分數(shù)1%鋨酸1.5 h，PBS洗3遍，梯度丙酮脫水，吸干液體，樹脂包埋。37 ℃烤箱過夜，切片、染色，透射電鏡(×4 200)下觀察。

1.8Western blot法測定面神經MBP、BDNF、 NGF蛋白的表達取面神經主干，加液氮研磨，加裂解液，在冰上裂解1 h，低溫離心15 min，吸取上清用BCA法進行蛋白定量。灌制分離膠、積層膠。上樣電泳，恒壓80 V、40 min，切下目的蛋白和內參，半干轉膜，恒流95 mA，60 min，將蛋白從SDS-PAGE凝膠轉至PVDF膜。脫脂奶粉封閉1 h。加一抗孵育，稀釋濃度比例：MBP(1∶50)，BDNF(1∶100)，NGF(1∶100)和β-actin(1∶200)。用TBST洗脫3次，每次5 min。用辣根過氧化物酶標記的二抗孵育2 h，TBST 洗膜3次，ECL化學發(fā)光顯影成像，用Im-age J 圖像分析軟件進行條帶灰度分析。以目的蛋白和內參條帶灰度值的比值作為目的蛋白的相對表達量。

1.9ELISA檢測面神經炎癥因子的分泌取面神經主干，用液氮研磨，加裂解液，在冰上裂解1 h，低溫離心15 min，收集上清凍存。按照試劑盒說明測定IL-1β、 IL-10、TNF-α、NF-κB含量。

1.10統(tǒng)計學處理采用SPSS 22.0分析數(shù)據(jù)。采用重復測量數(shù)據(jù)的方差分析比較3組大鼠造模后不同時間點面神經功能評分的差異，采用單因素方差分析比較3組大鼠其他指標的差異，兩兩比較采用LSD-t檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1術后一般情況及面神經功能評分3組大鼠實驗及觀察期間存活良好，切口無感染，無并發(fā)癥出現(xiàn)。假手術組大鼠瞬目反射靈敏，未出現(xiàn)觸須運動減弱，鼻尖位置居中。造模后第1、3、10、20、30天，模型組面神經功能評分均較假手術組升高，第20、30天，沃頓膠薄片組面神經功能評分較模型組降低，見表1。

表1 造模后不同時間點各組大鼠面神經功能評分

F組間=12.810，P<0.001；F時間=19.370，P<0.001；F交互=1.869，P=0.280；*：與假手術組相比，P<0.05；#：與模型組相比，P<0.05

2.2神經電生理測定結果術后第30天，模型組M波潛伏期升高，神經電位波幅降低，沃頓膠薄片組均較模型組改善，見表2。

表2 造模后第30天各組大鼠面神經電生理檢測結果

*：與假手術組相比，P<0.05；#：與模型組相比，P<0.05

2.3損傷段面神經病理學和超微結構改變損傷段面神經病理學改變：假手術組面神經主干纖維呈長條形，平行排列，細胞排列整齊，神經纖維束被束膜包裹，結構完整。模型組可見神經纖維連續(xù)性中斷，大量炎性細胞增生，軸突連續(xù)性消失，施萬細胞腫脹，分布散亂，出現(xiàn)脫髓鞘改變。沃頓膠薄片組神經損傷明顯減輕，可見再生的髓鞘，細胞分布欠均勻，再生毛細血管及膠質細胞增多，炎性細胞浸潤減少。超微結構改變：假手術組神經纖維髓鞘結構完整、板層結構清晰，無變性脫髓鞘情況，細胞器豐富。模型組電鏡下可見神經纖維腫脹，呈現(xiàn)脫髓鞘改變，髓鞘結構松散，呈空泡狀改變，并有沃勒變性后脫落的髓鞘。沃頓膠薄片組表現(xiàn)為髓鞘明顯增厚,但厚薄仍不均，髓鞘板層結構略松散，有少量空泡狀改變。見圖1。

A:病理學改變；B：超微結構；1～3：分別為假手術組、模型組、沃頓膠薄片組

2.4損傷段面神經主干MBP、BDNF及NGF蛋白的表達與假手術組相比，模型組損傷段面神經主干MBP、BDNF的表達減少，NGF的表達增多；與模型組相比，沃頓膠薄片組MBP、BDNF及NGF的表達增多，見圖2、表3。

2.5損傷段面神經炎癥因子分泌水平的比較模型組損傷段面神經IL-1β、IL-10、TNF-α、NF-κB的分泌高于假手術組，而沃頓膠薄片組IL-1β、IL-10、NF-κB的分泌降低，見表4。

1～3：分別為假手術組、模型組、沃頓膠薄片組

表3 3組大鼠損傷段面神經主干MBP、BDNF及NGF蛋白表達的比較

*：與假手術組相比，P<0.05；#：與模型組相比，P<0.05

表4 3組大鼠損傷段面神經炎癥因子水平的比較 mg/L

*：與假手術組相比，P<0.05；#：與模型組相比，P<0.05

3 討論

面神經損傷后常表現(xiàn)為周圍性面癱，如額紋消失、鼻唇溝變淺、口角歪斜、鼓腮漏氣等[4-5]，給患者帶了諸多不便。目前臨床上的治療方法主要有藥物治療、物理治療等[6]，但面神經損傷后的修復仍然是個棘手的問題。人臍帶沃頓膠是指臍帶去除外膜、動靜脈后剩余的膠凍樣組織，其中富含大量的間充質干細胞，具有分化能力強、免疫源性低等特點[7]，有實驗[8-9]證實其具有神經修復作用。

本實驗結果顯示通過面神經擠壓建立面神經損傷模型后模型大鼠面神經功能評分較假手術組升高，說明造模成功。面神經功能評估、神經電生理檢測及組織病理學和超微結構觀察顯示面神經損傷后發(fā)生脫髓鞘、髓鞘形成障礙及髓鞘形成延遲等病理改變。髓鞘結構由施萬細胞、軸突和基膜相互作用而形成，整個發(fā)育過程受到嚴格調控，任何環(huán)節(jié)的異常均可能導致髓鞘形成障礙或髓鞘結構異常，可導致相應的周圍神經病變。髓鞘還能為長距離神經沖動跳躍式傳導提供結構基礎，對神經有營養(yǎng)支持作用，可發(fā)揮促進損傷修復等作用[10]。本研究結果顯示，沃頓膠能夠改善面神經功能，促進髓鞘完整性的恢復。

MBP是髓鞘的主要結構蛋白，在中樞神經系統(tǒng)和周圍神經系統(tǒng)中均有表達，分別由少突膠質細胞和施萬細胞合成和分泌，占周圍髓鞘相關蛋白總量的15%～20%[11]。MBP對髓鞘保持緊密性具有重要的作用，可維持髓鞘結構和功能的穩(wěn)定，同時對于髓鞘形成具有啟動作用[12]。本實驗顯示沃頓膠能夠促進MBP的表達，對髓鞘起到修復作用。沃頓膠纖維結構之間有空隙存在，有利于營養(yǎng)物質供給和代謝廢物的排泄，有助于細胞增殖和細胞分泌外基質，此外其亦可分化為骨骼肌細胞、心肌細胞、軟骨細胞等[13-14]。我們推測沃頓膠這種結構可為髓鞘細胞提供細胞支架材料，有利于髓鞘的修復。此外，薄片修復可避免局部大的瘢痕及細胞分布不均。

沃頓膠通過對局部微環(huán)境的影響促進神經修復，是因為它可為這種生物修復過程提供各種細胞因子和生長因子[15]。研究[16]表明沃頓膠能夠促進NGF的分泌，抑制炎癥介質的釋放。本實驗結果顯示沃頓膠薄片組BDNF、NGF的表達高于模型組，而IL-10、IL-1β、NF-κB的分泌低于模型組，提示沃頓膠治療能夠增加神經營養(yǎng)因子BDNF、NGF的分泌，促進神經元的再生和分化，同時減輕面神經損傷后的炎癥反應，從而參與神經損傷的修復。

總之，沃頓膠薄片可促進大鼠面神經損傷后的髓鞘修復，改善大鼠面神經損傷后行為學及電生理情況，其機制可能與沃頓膠薄片上MBP的表達促進神經營養(yǎng)因子BDNF、NGF的分泌，減少炎癥因子IL-1β、IL-10、NF-κB的釋放，改善損傷區(qū)域局部微環(huán)境有關。