吳銀霞 ，陳成偉 ，傅青春 *，程明亮 ，張懿

（1.麗水市中心醫(yī)院，浙江 麗水 323000；2.中國人民解放軍第八五醫(yī)院，上海 200006；3.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，貴州 貴陽550025）

異煙肼（isoniazid，INH）是臨床一線抗結(jié)核藥，但也易誘發(fā)藥物性肝損傷 （Drug Induced Liver Injury，DILI）。研究表明，20%接受INH治療的患者其谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）升高，1%可出現(xiàn)嚴(yán)重肝毒性甚至肝衰竭[1-2]。早期研究認(rèn)為[3-4]，INH通過乙酰轉(zhuǎn)移酶2（NAT2）乙酰化，釋放游離肼產(chǎn)生肝毒性。后期研究[5]發(fā)現(xiàn)，INH肝毒性與個(gè)體易感性、遺傳多態(tài)性密切相關(guān)。近年來，Metushi等[6]在INH肝損傷患者體內(nèi)找到了抗INH抗體和自身抗體，認(rèn)為INH誘發(fā)藥物性肝損傷有免疫機(jī)制參與其中，但前期研究均未闡明其發(fā)病機(jī)制。線粒體是一個(gè)產(chǎn)生活性氧的場所，特別容易受到氧化應(yīng)激損傷。藥物性肝損傷大多能引起線粒體氧化應(yīng)激，如順鉑、對乙酰氨基酚引起的急性肝毒性，非阿尿苷和丙戊酸引起的肝臟小泡性脂肪變性，INH與利福平合用可引起線粒體氧化應(yīng)激和MPT膜孔開放等[7-8]。線粒體或許是藥物性肝損傷的最終作用靶點(diǎn)。因此，本文建立INH肝損傷動(dòng)物模型，研究INH肝毒性的線粒體損傷機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑 異煙肼原藥購自sigma公司。3-硝基酪氨酸（3-nitrotyrosine，3-NT）抗體和 4-羥基壬烯酸（4-hydroxynonenal，4-HNE）抗體生產(chǎn)廠商為北京博奧森生物技術(shù)有限公司，MitoQ購自蘇州沃盛化學(xué)有限公司，線粒體提取試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所，山梨醇脫氫酶（sorbitol dehydrogenase，SDH）試劑盒購自上海朗頓生物有限公司，其余試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 36只C57B/6J小鼠，SPF級，雄性，6周齡，體質(zhì)量20～25g，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司[許可證號：SCXK（滬）2007-0005]，飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。所有小鼠在實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性喂養(yǎng)1周[自由飲食水，晝夜均衡，溫度20～25℃，濕度（50±5）%]。采用隨機(jī)數(shù)字表法將小鼠分為對照組、模型組、MitoQ干預(yù)組，每組各12只，分別給予生理鹽水（10mL/kg）、異煙肼（100mg/kg）、異煙肼（100mg/kg）+線粒體抗氧化劑MitoQ進(jìn)行灌胃處理，2次/d，共造模14天。MitoQ干預(yù)組于造模前2周將飲用水配置成MitoQ（500uM）供小鼠自由飲用。每組再分成兩小組，每組各6只，分別于造模第5天和第14天處死，并進(jìn)行肝臟組織細(xì)胞及生理生化檢測。

1.3 標(biāo)本制備 所有小鼠于末次灌胃后禁食12小時(shí)，5%戊巴比妥鈉0.1mL/20g腹腔注射麻醉，采用眼球摘除法收集血液，儲(chǔ)存于1.5mL離心管，室溫靜置4小時(shí)，3000rpm離心10分鐘，提取血清-20℃保存?zhèn)溆?。頸椎脫臼法處死小鼠，剖腹完整剝離肝臟組織，剪取5mm×5mm×2mm肝組織放入10%福爾馬林固定，用于制作肝臟病理切片。在冰上稱取50mg肝臟組織，當(dāng)即用試劑盒提取線粒體，剩余肝組織-80℃保存，用于后續(xù)指標(biāo)檢測。

1.4 指標(biāo)檢測 （1）ALT和AST按試劑盒說明書采用微板法進(jìn)行操作，用酶標(biāo)儀測定510nm波長處各孔OD值，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得出ALT和AST的卡門氏單位，并換算成酶活力單位IU/L。1卡門氏單位=0.482IU/L。（2）SDH 檢測根據(jù)小鼠山梨醇脫氫酶試劑盒說明進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測。（3）LDH按試劑盒說明書測定酶標(biāo)儀450nm處的吸光度。（4）T-GSH和GSSG檢測取凍存的肝臟組織進(jìn)行勻漿，用BCA法測定樣本蛋白濃度，按試劑盒說明書在412nm處分別檢測兩者的吸光度，通過公式計(jì)算GSH和GSSG含量。（5）ATP采用比色法檢測其在636nm處的吸光度，通過公式計(jì)算ATP含量。（6）NADH和FADH采用雙抗體一步夾心法ELISA，用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），計(jì)算樣品活性（U/mL）。（7）線粒體膜電位測定（Δψ）：JC-1 是檢測 Δψ 的理想熒光探針，提取線粒體后用線粒體緩沖液調(diào)整蛋白濃度至1mg/mL，然后按JC-1膜電位檢測試劑盒說明書配制JC-1染色工作液，取24孔板，在0.9mL 5倍稀釋的JC-1染色工作液中加入0.1mL純化的線粒體。用熒光酶標(biāo)儀將激發(fā)波長設(shè)置為485nm，發(fā)射波長設(shè)置為590nm進(jìn)行檢測。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料用（±s）表示，正態(tài)性檢驗(yàn)后做方差齊性檢驗(yàn)，多組間比較方差齊性者采用單因素方差分析，SNK法分析組間差異；方差不齊者采用秩和檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 造模情況 MitoQ干預(yù)組小鼠給予INH 100mg/kg，5天后6只中4只發(fā)生輕度肝臟脂肪變性，以局部小泡性改變?yōu)橹鳎?4天后6只剩余小鼠均發(fā)生肝臟脂肪病變，肝細(xì)胞內(nèi)彌漫性小泡性脂肪變性，血管周圍輕度炎癥，有嗜酸性粒細(xì)胞浸潤，中央靜脈旁有點(diǎn)狀壞死，凋亡小體（圖1）。按照DILI半定量評分表[9]，評為5分，定義為“很可能”，說明造模成功。

2.2 肝臟病理表現(xiàn) 對照組肝小葉結(jié)構(gòu)正常，未見炎癥細(xì)胞浸潤（圖2A-2B）。模型組5天后有4只小鼠發(fā)生輕度脂肪變性，局部小泡性脂肪變性（圖2C）；14天后所有小鼠均發(fā)生肝臟彌漫性脂肪變，甚至可見嗜酸性粒細(xì)胞浸潤和凋亡小體 （圖2D）。MitoQ干預(yù)組5天后僅1只小鼠出現(xiàn)輕度脂肪變性 （圖2E），14天后小葉中央靜脈旁脂肪變性減輕，有少量炎癥細(xì)胞浸潤（圖2F）。

圖2 各組肝臟病理組織學(xué)表現(xiàn)（×400）

2.3 肝臟損傷指標(biāo)

2.3.1 肝功能指標(biāo) 與對照組比較，造模后5天模型組LDH有顯著升高（P＜0.05），SDH于14天時(shí)顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），兩組ALT、AST 差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；MitoQ 干預(yù)后5天及14天，LDH均較模型組顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。詳見表1。

2.3.2 肝臟氧化應(yīng)激指標(biāo) 與對照組比較，造模后5天及 14天模型組 GSSG、GSSG/GSH、4-HNE及3-NT均明顯升高 （均P＜0.05），GSH則顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。MitoQ 干預(yù)后，GSSG、GSSG/GSH、4-HNE及3-NT均較模型組明顯下降，GSH則顯著回升，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （均P＜0.05）。 詳見表 2。

2.3.3 肝臟線粒體指標(biāo) 與對照組比較，造模后5天及14天模型組NADH、FADH、ATP、線粒體膜電位均明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （均P＜0.05）。MitoQ干預(yù)后，NADH、FADH、ATP較模型組均顯著升高，但線粒體膜電位下降更明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。 詳見表 3。

表1 各組小鼠生化指標(biāo)比較（x±s）

表2 各組肝臟氧化應(yīng)激指標(biāo)比較（x±s）

表3 各組肝臟線粒體指標(biāo)比較（x±s）

3 討論

近年DILI的發(fā)病率逐年增多，而脂肪變性則是其基本病理類型。INH在多種動(dòng)物模型上均可誘發(fā)小泡性脂肪變性[10-11]，Metushi等[12]則發(fā)現(xiàn)INH在小鼠體內(nèi)的代謝與人體更為相似，小鼠可能更適合作為INH肝損傷的動(dòng)物模型。INH在體內(nèi)代謝較快，小劑量多次給藥比單次大劑量給藥更容易引起肝損傷[13]，因此本研究選擇1天2次給藥的方式進(jìn)行造模。在預(yù)實(shí)驗(yàn)時(shí)觀察1-30天不同劑量連續(xù)INH給藥，發(fā)現(xiàn)小鼠INH 100mg/kg連續(xù)5天即可發(fā)生部分肝損傷現(xiàn)象，連續(xù)給藥2周可發(fā)生彌漫性肝臟脂肪變性?；谠炷ＰЧ?、時(shí)間、經(jīng)濟(jì)成本等諸多因素，最終本研究選擇5天和14天兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行分組研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，INH給藥劑量為100mg/kg，連續(xù)給藥5天可引起部分小鼠發(fā)生局部小泡性脂肪變性，可見散在嗜酸粒細(xì)胞；而連續(xù)給藥14天可致全部小鼠發(fā)生彌漫性小泡性脂肪變性，嗜酸粒細(xì)胞及凋亡小體均較5天增多，可以達(dá)到最佳造模效果。

本研究病理模型顯示，INH引起肝臟彌漫性小泡性脂肪變性，而藥物誘導(dǎo)肝臟脂肪變性通常與線粒體損傷相關(guān)[14]。線粒體的主要功能是產(chǎn)生能量，參與細(xì)胞內(nèi)三羧酸循環(huán)、脂肪酸代謝及氧化磷酸化。藥物可通過多方面損傷線粒體[15-17]，如抑制線粒體呼吸鏈，導(dǎo)致ATP合成受阻；破壞抗氧化防御系統(tǒng)，引起氧化損傷；抑制脂肪酸β-氧化，引起肝臟脂肪變性；損傷線粒體DNA（mtDNA），抑制線粒體的新生和修復(fù)；MPT膜孔開放，引起線粒體膜破裂等。本研究結(jié)果顯示，與對照組比較，模型組線粒體功能損傷顯著，如傳遞電子和質(zhì)子的線粒體呼吸鏈NADH、FADH活性明顯下降，其功能異?？芍苯佑绊懢€粒體內(nèi)的β-氧化和三羧酸循環(huán)。同時(shí)，模型組ATP明顯減少，ATP是生物體內(nèi)能量轉(zhuǎn)換最基本的載體，其含量變化直接關(guān)系到各器官的能量代謝。Lee等[18]在細(xì)胞水平上同樣發(fā)現(xiàn)了INH對線粒體呼吸鏈NADH的影響。線粒體膜電位下降是細(xì)胞凋亡早期的標(biāo)志性事件，模型組線粒體膜電位明顯下降，說明線粒體膜受到了直接損傷。

本研究發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激或許在線粒體損傷中也起到了關(guān)鍵作用，模型組GSSG、GSSG/GSH升高，說明INH引起了肝組織發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)。同時(shí)，肝臟脂質(zhì)過氧化指標(biāo)4-HNE、活性氧及活性氮的硝基化指標(biāo)3-NT在模型組中的表達(dá)增加，說明肝細(xì)胞生物膜同樣發(fā)生了氧化損傷。因此，INH可通過氧化應(yīng)激引起肝臟線粒體損傷，進(jìn)而導(dǎo)致肝臟脂肪變性。MitoQ是目前為止最好的線粒體靶向抗氧化劑，它能將泛醌與親脂性三苯基膦（TPP）陽離子共價(jià)結(jié)合，通過線粒體膜電位進(jìn)入線粒體內(nèi)，吸附于內(nèi)膜表面，發(fā)揮抗氧化作用[19]。最近報(bào)道[20-21]指出，MitoQ能保護(hù)心臟缺血再灌注損傷、干預(yù)糖尿病腎病、阿霉素的心臟毒性和丙型肝炎等。本研究同樣發(fā)現(xiàn)，MitoQ能有效干預(yù)氧化應(yīng)激指標(biāo)GSSG和4-HNE、3-NT的表達(dá)，減輕肝臟脂肪變性，同時(shí)對線粒體呼吸鏈的活性和ATP含量有一定保護(hù)作用。這為臨床DILI患者預(yù)防性應(yīng)用抗氧劑提供了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支持。但本研究中，MitoQ干預(yù)后14天，反應(yīng)肝臟線粒體功能的其他指標(biāo)開始恢復(fù)時(shí)，MitoQ干預(yù)組線粒體膜電位下降更顯著，說明MitoQ對線粒體膜電位無保護(hù)作用，但該推測還有待于后續(xù)實(shí)驗(yàn)來證實(shí)。

值得指出的是，作為臨床肝損傷可靠指標(biāo)的ALT、AST等肝臟氨基轉(zhuǎn)移酶在本研究各組中無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，Hassan等[22]認(rèn)為可能與INH給藥持續(xù)時(shí)間有關(guān)，將INH給藥時(shí)間延長至4周時(shí)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)氨酶水平明顯升高。因此，將血清轉(zhuǎn)氨酶水平作為INH肝毒性的判斷標(biāo)準(zhǔn)并不可靠。SDH主要分布于肝臟，血清中活性很低，如酶活力升高，強(qiáng)烈提示肝臟損傷。血清SDH在發(fā)病1周后可達(dá)到峰值，對INH肝損傷評估有一定的參考價(jià)值[23]。

綜上所述，INH肝毒性的發(fā)病機(jī)制中無論是毒性代謝產(chǎn)物還是免疫損傷機(jī)制的參與，線粒體都可能是其最終的作用靶點(diǎn)，直接阻斷線粒體損傷或許能阻止INH肝毒性的發(fā)生，而預(yù)防性使用抗氧化劑則可有效減輕肝臟損傷。