劉士明，丁濤，雷良玉，胡琳，冒靈，陳超，郭萌萌，徐林

0 引言

結(jié)直腸癌是人類最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)生發(fā)展機制的闡明對于診斷、治療及預(yù)后均有重要意義[1-5]。Ⅰ型輔酶脫氫酶1α亞復(fù)合物4（NADH dehydrogenase 1 alpha subcomplex 4,NDUFA4），是由定位于人7號染色體p21.3上的NDUFA4基因編碼的線粒體呼吸鏈蛋白質(zhì)，也是哺乳動物線粒體細胞色素C氧化酶（COX; ComplexⅣ）中的重要亞基，能夠?qū)㈦娮訌腘ADH轉(zhuǎn)移至呼吸鏈，參與能量代謝[6-8]。研究顯示NDUFA4的異常表達與包括腫瘤在內(nèi)的多種疾病發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[9-12]。我們課題組前期發(fā)現(xiàn)NDUFA4過表達可促進人肺癌細胞的增殖和侵襲[13]。然而，NDUFA4在人結(jié)直腸癌發(fā)生中的可能作用和研究機制尚未闡明。因此，本研究利用前期構(gòu)建的p-NDUFA4真核表達載體，觀察NDUFA4過表達對人結(jié)直腸癌細胞體外生長的可能影響并探討其機制，以期為后續(xù)研究NDUFA4在人結(jié)直腸癌發(fā)生中的作用提供前期實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒、細胞株和主要試劑

人結(jié)直腸癌HCT116細胞株購自中國生命科學(xué)院，質(zhì)粒p-NDUFA4和p-Cont均由本實驗室保存。McCoy's 5A細胞培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Gibco公司；100×三抗（青霉素-鏈霉素-兩性霉素B）購自上海第四制藥股份有限公司；CCK-8試劑盒購自東仁化學(xué)科技（上海）有限公司；1%結(jié)晶紫染液購自北京索萊寶科技有限公司；Lipofectamine3000試劑購自賽默飛世爾科技公司;SYBR Premix Ex Taq，Premix Ex Taq Version2.0，以及RNAisoTMPlus均購自北京寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司；RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄合成試劑盒購自美國Fermentas公司；總RNA提取試劑盒購自北京天根科技有限公司，兔抗NDUFA4、β-actin、p-AKT、AKT一抗以及兔抗ERK1/2、p-ERK1/2一抗、HRP標記的羊抗兔二抗均購自Abcam公司（英國的劍橋科學(xué)園）；全蛋白提取試劑盒、ECL顯色液、RIPA裂解液均購自上海生工生物工程股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 重組質(zhì)粒p-NDUFA4瞬時轉(zhuǎn)染人結(jié)直腸癌HCT116細胞

將人結(jié)直腸癌HCT116細胞株置于10%優(yōu)質(zhì)胎牛血清、100×三抗（青霉素-鏈霉素-兩性霉素B）、McCoy's 5A細胞培養(yǎng)液中培養(yǎng)，待HCT116細胞密度達到80%左右時，使用0.25%胰蛋白酶37℃消化2 min，離心收集細胞，使用PBS重復(fù)沖洗3次后備用。細胞實驗分組：空載體對照組（p-Cont）、重組質(zhì)粒實驗組（p-NDUFA4）。以每孔1×105個細胞鋪于6孔板中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h后，按照Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑盒說明書進行轉(zhuǎn)染，并于熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染細胞的形態(tài)學(xué)變化和轉(zhuǎn)染效率。

1.2.2 實時熒光定量PCR和Western blot檢測轉(zhuǎn)染細胞中NDUFA4的表達

總RNA的提取參考文獻[13]。按照RevertAidTM First Strand cDNA合成試劑盒說明書的反應(yīng)條件和反應(yīng)體系進行RNA反轉(zhuǎn)錄。

1.2.2.1 Real-time PCR反應(yīng) 反應(yīng)體系：TaKaRa PCR Mix 10 μl，cDNA 2 μl，NDUFA4 1 μl，上下游引物各0.5 μl，ddH2O 6 μl。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s；95℃ 15 s、60℃ 1 min，40個循環(huán)。以GADPH為內(nèi)參照，NDUFA4基因的PCR引物序列：上游引物：5'-TCCCCCTCTTTGTATTTATTG G-3'；下游引物：5'-GGGCTCTGGGTTATTTCTGT C-3'。反應(yīng)結(jié)束后，采用2-ΔΔCt法計算NDUFA4的相對表達量[13]。

1.2.2.2 Western blot檢測轉(zhuǎn)染細胞中NDUFA4的表達 （1）制備濃縮膠和分離膠：10%分離膠，5%濃縮膠；（2）跑膠：SDS-PAGE電泳80 V跑濃縮膠，120 V跑分離膠；（3）上樣：將蛋白樣品上樣到SDS-PAGE膠加樣孔內(nèi)；（4）電泳1 h；（5）轉(zhuǎn)膜：將目的蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜（30 min）；（6）封閉：轉(zhuǎn)膜完畢后立刻把蛋白置于含5%脫脂奶粉的TBST中，封閉1 h；（7）一抗孵育：將兔抗人的β-actin、NDUFA4（1:2 000）加入上述封閉液中孵育，4℃冰箱過夜；（8）洗膜：24 h后用TBST洗膜，10 min×3次；（9）二抗孵育、洗膜：將含有NDUFA4蛋白的HRP標記的羊抗兔二抗（1:2 000）加入含PBST的孵育膜，1 h；PBST洗膜，10 min×3次；（10）加入等量發(fā)光試劑，進行蛋白曝光。以β-actin作為內(nèi)參分析結(jié)果。

1.2.3 CCK-8法檢測HCT116細胞的增殖情況

以每孔1×104個細胞接種至96孔板，并設(shè)置三個復(fù)孔，每孔加入細胞懸液和培養(yǎng)液的總量為200 μl，待細胞密度達90%，Lipofectamine3000瞬時將p-NDUFA4質(zhì)粒和p-Cont質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人結(jié)直腸癌HCT116細胞。在指定的時間分別向每孔加入10 μl CCK-8試劑，并置于37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)3 h，在酶標儀主波長為450 nm處讀取每孔吸光度（OD）值變化。

1.2.4 克隆形成實驗檢測HCT116細胞的克隆形成能力

收集已轉(zhuǎn)染的細胞，制成細胞懸液，細胞懸液反復(fù)吹打，使單個細胞百分率在95%以上，并進行細胞計數(shù)，調(diào)整細胞懸液密度為1×103個/毫升細胞，并以400個/孔和1 000個/孔接種于6孔板中，用于克隆形成實驗，然后將細胞置于37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)2~3周。當出現(xiàn)肉眼可見克隆時，終止培養(yǎng)，棄去培養(yǎng)液，PBS液小心清洗3次，空氣干燥。甲醇固定15 min，棄甲醇后空氣干燥。1%結(jié)晶紫染液染色菌落，并對菌落直徑和數(shù)量進行統(tǒng)計學(xué)分析。

1.2.5 實時熒光定量PCR檢測HCT116細胞中與生長相關(guān)基因的表達

細胞周期蛋白依賴性激酶（cyclin- dependent kinase, CDK）表達的檢測同前期工作[13]。

1.2.6 Western blot檢測HCT116細胞中AKT、ERK1/2、磷酸化AKT、磷酸化ERK1/2蛋白的表達情況

細胞蛋白質(zhì)樣品的制備及BCA法定量蛋白的檢測、Western blot檢測AKT等相關(guān)信號通路的變化的方法參考文獻[13]。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

GraphPad Prism 5.0軟件統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)。所有數(shù)據(jù)均獨立重復(fù)3次，實驗數(shù)值結(jié)果以（x±s）表示。其中計量資料組間比較采用Student t檢驗或單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 瞬時轉(zhuǎn)染p-NDUFA4重組質(zhì)粒后HCT116細胞中NDUFA4的表達

結(jié)果顯示：與p-Cont組相比，p-NDUFA4組中NDUFA4 mRNA和蛋白表達水平均明顯上調(diào)（Pm-RNA=0.0015，P蛋白=0.0024），見圖1。

圖1 p-NDUFA4轉(zhuǎn)染HCT116細胞后NDUFA4 mRNA(A)和蛋白(B)的表達Figure1 Expression levels of NDUFA4 mRNA(A) and protein(B) in human colon cancer HCT116 cells transfected with p-NDUFA4

2.2 NDUFA4過表達促進HCT116細胞體外生長

結(jié)果顯示：與p-Cont組相比，轉(zhuǎn)染24 h時，p-NDUFA4組細胞的增殖無明顯差異（P=0.0546）；但從48 h開始，p-NDUFA4組細胞的增殖均明顯高于p-Cont組細胞（P48h=0.0077;P72h=0.0033; P96h=0.0442; P120h=0.0310），見圖2。

圖2 NDUFA4過表達對HCT116細胞增殖的影響Figure2 Effects of NDUFA4 overexpression on proliferation of HCT116 cells

2.3 NDUFA4過表達促進HCT116細胞的克隆形成能力

結(jié)果顯示：與p-Cont組相比，p-NDUFA4組HCT116細胞的克隆形成率較p-Cont組明顯增加（P400/well=0.0015, P1000/well=0.0011），見圖3。

2.4 NDUFA4過表達促進細胞周期蛋白依賴性激酶的表達

結(jié)果顯示：與p-Cont組相比，p-NDUFA4

圖3 NDUFA4過表達對HCT116細胞克隆形成的影響Figure3 Effects of NDUFA4 overexpression on clonal formation of HCT116 cells

圖4 NDUFA4過表達對細胞中細胞生長周期相關(guān)的CDKs表達的影響Figure4 Effects of NDUFA4 overexpression on CDKs expression related with cell cycle of HCT116 cells

2.5 Western blot檢測各組轉(zhuǎn)染細胞中相關(guān)信號通路表達情況

結(jié)果顯示：與p-Cont組相比，p-NDUFA4組中p-ERK1/2、p-AKT的蛋白表達水平明顯增加（Pp-ERK1/2= 0.0075, Pp-AKT=0.0254），見圖5。組中腫瘤細胞生長周期相關(guān)的周期蛋白依賴性激酶CDK3和CDK4的表達水平均顯著上調(diào)（PCDK2=0.0285, PCDK3=0.0025, PCDK4=0.0197,PCDK6=0.0046），見圖4。

3 討論

NDUFA分子參與了腫瘤發(fā)生發(fā)展過程，且不同的NDUFA分子在特定腫瘤中的表達功能存在差異[14]。例如，NDUFA13在人肺癌組織中表達量明顯下降，與腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)行為存在密切聯(lián)系[15]。陸仁飛等[16]發(fā)現(xiàn)人結(jié)直腸癌患者標本中NDUFA13的表達顯著下調(diào)，且高表達NDUFA13能夠抑制結(jié)直腸癌細胞的增殖。此外，NDUFA4L2在不同癌中的表達量存在明顯差異，其在肝細胞癌、神經(jīng)母細胞瘤、腎透明細胞癌中表達量上調(diào)[17-18]。這些研究提示NDUFA家族分子參與腫瘤發(fā)生過程中的復(fù)雜性。因此，探討不同NDUFA家族分子在特定腫瘤發(fā)生中的作用不僅有利于NDUFA家族分子生物學(xué)功能的解析，而且對于相關(guān)腫瘤發(fā)生機制認識和臨床生物防治新策略開發(fā)均具有重要意義。

作為NDUFA家族成員之一，NDUFA4也參與了腫瘤的發(fā)生過程[12]。我們在前期研究中發(fā)現(xiàn)，腫瘤抑癌分子微小RNA-7可抑制肺癌中NDUFA4的表達，且過表達NDUFA4可促進人肺癌細胞的生長[13]。本研究，我們將前期構(gòu)建的p-NDUFA4真核表達載體瞬時轉(zhuǎn)染HCT116細胞，發(fā)現(xiàn)細胞中NDUFA4的表達水平明顯增加，提示該載體可在人結(jié)直腸癌細胞中有效表達NDUFA4分子，這與我們前期工作一致。重要的是，CCK-8實驗和克隆形成實驗顯示，上調(diào)NDUFA4表達后，HCT116細胞的增殖能力和克隆形成能力明顯增強。為了進一步明確NDUFA4過表達對人結(jié)直腸癌細胞體外生長的效應(yīng)，我們進一步檢測了

細胞中生長周期相關(guān)分子CDKs家族成員的表達，發(fā)現(xiàn)CDK2和CDK3等家族成員明顯上調(diào)，提示NDUFA促進人結(jié)直腸癌細胞體外生長的效應(yīng)與細胞周期變化有關(guān)?，F(xiàn)已知，AKT和ERK信號途徑與腫瘤細胞生長密切相關(guān)[19-21]，且與細胞呼吸鏈能量傳遞存在關(guān)聯(lián)[22-24]。因此，我們檢測了細胞中p-AKT和p-ERK等蛋白的表達情況，且發(fā)現(xiàn)p-AKT和p-ERK等蛋白的表達水平均明顯上調(diào)。這些研究結(jié)果提示，NDUFA4過表達促進人結(jié)直腸癌細胞體外生長的效應(yīng)可能與相關(guān)信號途徑傳遞變化有關(guān)。然而，鑒于NDUFA4分子在細胞能量代謝中的重要作用，以及AKT等信號途徑與能量代謝的密切關(guān)系，因此，NDUFA4過表達對人結(jié)直腸癌細胞體外生長的作用機制，包括細胞能量代謝改變，仍有待后續(xù)研究闡明。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)過表達NDUFA4可促進人結(jié)直腸癌細胞的體外生長，且AKT和ERK等信號途徑傳遞發(fā)生變化，為后續(xù)深入NDUFA4在人結(jié)直腸癌發(fā)生中的作用及相關(guān)機制提供了重要的前期實驗基礎(chǔ)。

圖5 NDUFA4過表達對HCT116細胞中AKT、ERK1/2和AKT、ERK1/2磷酸化水平的影響Figure5 Effects of NDUFA4 overexpression on expression levels of AKT, ERK1/2, p-AKT and p-ERK1/2 in HCT116 cells