宋鵬，龍彤，梁培育，歐善際

[編輯：安鳳；校對：黃園玲]

0 引言

前列腺癌（prostate cancer, PCa）是男性泌尿生殖系統(tǒng)發(fā)病率較高的惡性腫瘤之一，近年來我國前列腺癌發(fā)病率呈上升趨勢[1]。因此，研究前列腺癌的致癌機(jī)制，開發(fā)新的研究方法，對挽救前列腺癌患者的生命具有重大意義。隨著二代測序技術(shù)的發(fā)展，大量對長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA, lncRNA）的深入研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)一些異常表達(dá)的lncRNA與腫瘤的發(fā)生與發(fā)展有關(guān)[2-4]。

肺腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄子1（metastasisassociated lung adenocarcinoma transcript 1,MALAT1）屬于lncRNA中的一種，研究發(fā)現(xiàn)，book=412,ebook=30MALAT1的表達(dá)與癌細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移、成瘤率及血管生成密切相關(guān)[5]。本研究以激素依賴性的前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C3、LNCaP為對象，構(gòu)建MALAT1過表達(dá)及干擾模型，通過對MALAT1過表達(dá)（或干擾后）前列腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為變化的檢測，探討MALAT1在前列腺癌增殖中的作用機(jī)制，為研究前列腺癌發(fā)生發(fā)展機(jī)制奠定一定的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

激素依賴性前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C3和LNCaP（武漢華聯(lián)科生物技術(shù)有限公司，中國武漢）；載體pCDH、pSICOR（Addgene，美國）；RPMI 1640培養(yǎng)基（HyClone，美國）；胎牛血清（Gibco，美國）；TRIzol（Ambion，美國）；YBR Green PCR試劑盒（KAPA Biosystems，美國）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa，中國大連）；PBS、胰蛋白酶、MTT、瑞氏-姬姆薩復(fù)合染液（Bioswamp，中國）；細(xì)胞周期檢測試劑盒、凋亡檢測試劑盒（BD，美國）；Matrigel（Corning，美國）；兔抗人Cyclin D1單克隆抗體、兔抗人Bcl-2單克隆抗體、兔抗人Bax單克隆抗體及兔抗人ERK1/2單克隆抗體（Abcam，英國）；兔抗人p-ERK1/2單克隆抗體（CST，美國）。

1.2 細(xì)胞復(fù)蘇與培養(yǎng)

將凍存的PC3及LNCaP細(xì)胞從液氮罐中取出后，移至37℃水浴中，將細(xì)胞懸液吸至離心管中，1 000 r/min離心3 min，棄上清液，在含10%胎牛血清的新鮮RPMI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并置于37℃、含體積分?jǐn)?shù)為5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)。

1.3 構(gòu)建MALAT1過表達(dá)及siRNA載體

為了探討lncRNA-MALAT1對前列腺癌細(xì)胞增殖的作用機(jī)制，本研究構(gòu)建了MALAT1過表達(dá)載體pCDH-MALAT1和干擾載體pSICOR-shMALAT1，以及起對照作用的過表達(dá)空載體和干擾空載體。MALAT1-siRNA序列：5’-TGTACTAT CCCATCACTGAAG-3’。

1.4 熒光定量PCR檢測MALAT1相對表達(dá)量

利用TRIzol提取PC3細(xì)胞的總RNA，反轉(zhuǎn)錄生成cDNA，進(jìn)行Real-time PCR擴(kuò)增。MALAT1擴(kuò)增引物序列：上游引物：5’-CCGCTGCTATTAGAATGC-3’；下游引物：5’-CT TCAACAATCACTACTCCAA-3’。內(nèi)參基因β-Actin上游引物：5’-ACACTGTGCCCATCTACG-3’；下游引物：5’-TGTCACGCACGATTTCC-3’。PCR反應(yīng)條件：95℃ 3 min；95℃ 5 s；56℃ 10 s；72℃ 25 s，共39個(gè)循環(huán)。

1.5 MTT檢測細(xì)胞增殖

取對數(shù)生長期細(xì)胞，調(diào)整濃度并分于96孔板，每種細(xì)胞設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，37℃培養(yǎng)過夜。根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組：（1）對照組（Control）；（2）過表達(dá)空載體組（EV）；（3）干擾空載體組（si-EV）；（4）MALAT1過表達(dá)組（MALAT1）；（5）MALAT1-siRNA干擾組（si-MALAT1），分組處理細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)24、48和72 h。取出不同分組的細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔加入20 μl MTT溶液（5 mg/ml），繼續(xù)培養(yǎng)4 h。最后用酶聯(lián)免疫檢測儀測量各孔490 nm處的吸光度值。

1.6 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期及凋亡

收集胰酶消化處理后的不同細(xì)胞，PBS清洗兩次以后，加入400 μl碘化丙啶（propidium iodide, PI）溶液（50 μg/ml），避光染核10 min，用流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞含量，確定細(xì)胞在有絲分裂各個(gè)時(shí)期所占的比例。將細(xì)胞重懸于200 μl結(jié)合緩沖液中，并加入5 μl Annexin V-FITC和5 μl PI溶液，輕輕混勻，4℃避光孵育30 min。最后，加入300 μl緩沖液，隨即用流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞凋亡情況。

1.7 基質(zhì)膠檢測成管能力

在96孔板中加入50 μl Matrigel基質(zhì)膠，在凝膠過程中，消化各組細(xì)胞并用PBS重懸，制備細(xì)胞懸液，加入100 μl細(xì)胞懸浮液。37℃孵育，14 h后觀察細(xì)胞成管情況。

1.8 平板克隆檢測細(xì)胞成瘤率

取對數(shù)生長期的細(xì)胞，胰蛋白酶消化處理后吹打成單個(gè)細(xì)胞，并培養(yǎng)于含10%胎牛血清的培養(yǎng)液中備用。將細(xì)胞梯度稀釋，放置于37℃、5%CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2~3周。4%多聚甲醛固定細(xì)胞，加適量GIMSA染色液進(jìn)行染色。

1.9 Western blot檢測細(xì)胞周期及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)

本研究利用Western blot實(shí)驗(yàn)檢測了Cyclin D1、Bcl-2、Bax及ERK1/2和p-ERK1/2蛋白的表達(dá)水平，實(shí)驗(yàn)過程如下：提取細(xì)胞蛋白并置于沸水浴中10 min，使蛋白變性。利用SDS-PAGE膠分離蛋白，電泳結(jié)束后濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜上。5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入一抗室溫孵育1 h，PBST洗膜3次，再加入二抗（1:10 000稀釋HRP標(biāo)記），室溫孵育1 h。PBST洗滌三次后用ECL化學(xué)發(fā)光檢測并拍照。

book=413,ebook=31

1.1 0 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 MALAT1在PC3中的相對表達(dá)量

熒光定量PCR檢測前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C3對照組、EV組、si-EV組、MALAT1組及si-MALAT1組中l(wèi)ncRNA-MALAT1的相對表達(dá)量。對照組與EV組、si-EV組的MALAT1相對表達(dá)量之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與對照組相比，MALAT1組中MALAT1表達(dá)量明顯上調(diào)（P<0.01），si-MALAT1組中MALAT1表達(dá)量明顯下調(diào)（P<0.01），說明MALAT1過表達(dá)和干擾細(xì)胞株構(gòu)建成功，見圖1。

圖1 PC3中MALAT1的相對表達(dá)量Figure1 Relative expression of MALAT1 mRNA in PC3 cells

2.2 MALAT1對前列腺癌細(xì)胞體外增殖能力的影響

MTT檢測了培養(yǎng)24、48及72 h的PC3和LNCaP細(xì)胞株的細(xì)胞增殖情況，描繪對照組和四組實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的生長曲線。結(jié)果顯示，MALAT1組的前列腺癌細(xì)胞體外增殖能力明顯高于對照組和EV組（P<0.01）；si-MALAT1組的前列腺癌細(xì)胞的增殖能力明顯低于對照組和si-EV組（P<0.01），見圖2。

2.3 MALAT1對前列腺癌細(xì)胞周期和凋亡的影響

PC3和LNCaP細(xì)胞中MALAT1組處于靜止期和DNA合成前期（G0/G1期）的細(xì)胞數(shù)量多于對照組，在DNA合成期（S期）的細(xì)胞少于對照組；si-MALAT1組處于G0/G1期的細(xì)胞數(shù)量少于對照組，而S期細(xì)胞多于對照組，見圖3。MALAT1組的細(xì)胞凋亡率與對照組細(xì)胞凋亡率相近；si-MALAT1組的細(xì)胞凋亡率高于對照組，見圖4。

2.4 MALAT1對前列腺癌細(xì)胞血管形成能力的影響

PC3、LNCaP細(xì)胞中，與對照組比較，MALAT1組細(xì)胞形成的管狀結(jié)構(gòu)更多，在主要的管狀結(jié)構(gòu)附近聚集的血管內(nèi)皮層細(xì)胞也更多，更容易形成分支。而si-MALAT1組的內(nèi)皮層細(xì)胞少，基本沒有形成管狀結(jié)構(gòu)，見圖5。

2.5 MALAT1對前列腺細(xì)胞克隆形成能力的影響

MALAT1組的PC3、LNCaP細(xì)胞的克隆數(shù)量明顯多于對照組，說明MALAT1組細(xì)胞的克隆形成能力明顯增強(qiáng)。si-MALAT1組的細(xì)胞數(shù)量明顯少于對照組，克隆形成能力減弱，見圖6。

2.6 MALAT1對Cyclin D1、Bcl-2、Bax及p-ERK1/2蛋白表達(dá)的影響

與對照組相比，MALAT1組細(xì)胞中參與周期調(diào)控的Cyclin D1蛋白、抗凋亡蛋白Bcl-2及磷酸化的細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（p-ERK1/2）的表達(dá)水平顯著升高（P<0.01），而促凋亡蛋白Bax的表達(dá)水平明顯降低（P<0.01）；si-MALAT1組的Cyclin D1、Bcl-2和p-ERK1/2蛋白表達(dá)水平顯著降低（P<0.05或P<0.01），Bax表達(dá)水平升高（P<0.01），見圖7。

圖2 MALAT1對細(xì)胞增殖能力的影響Figure2 Effects of MALAT1 on proliferation of PC3 and LNCaP cells in vitro

book=414,ebook=32

圖3 MALAT1對PC3、LNCaP細(xì)胞周期的影響Figure3 Effects of MALAT1 on cell cycle of PC3 and LNCaP cells

圖4 MALAT1對PC3、LNCaP細(xì)胞凋亡的影響Figure4 Effects of MALAT1 on apoptosis of PC3 and LNCaP cells

圖5 MALAT1對PC3、LNCaP細(xì)胞血管形成的影響 (×100)Figure5 Effects of MALAT1 on angiogenesis of PC3 and LNCaP cells (×100)

book=415,ebook=33

3 討論

前列腺癌的發(fā)病率隨著生活質(zhì)量的提高呈現(xiàn)上升趨勢，對前列腺癌的發(fā)生和發(fā)展研究也隨之增多。近些年研究發(fā)現(xiàn)lncRNA在前列腺癌的發(fā)生發(fā)展過程中扮演了重要的角色：Chung等研究發(fā)現(xiàn)PRNCR1（前列腺非編碼RNA1）-siRNA會(huì)減弱前列腺癌細(xì)胞的生存、增殖能力和雄激素受體的活性，揭示PRNCR1通過影響雄激素受體活性參與前列腺癌的發(fā)生過程，為前列腺癌的發(fā)病機(jī)制提供了新的認(rèn)識(shí)[6]；lncRNA SOCS2-ASI可以促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞的生長、抑制凋亡，對前列腺癌的發(fā)生發(fā)展影響甚大[7]；Liu等發(fā)現(xiàn)lncRNA-PVTI在前列腺癌發(fā)生過程中表達(dá)上調(diào)，進(jìn)一步研究其影響機(jī)制，發(fā)現(xiàn)lncRNA-PVTI與miR-146a存在調(diào)控關(guān)系，過表達(dá)lncRNA-PVTI或沉默miR-146a，可明顯提高前列腺癌細(xì)胞的活力，抑制細(xì)胞凋亡[8]。

MALAT1是一種致癌性的長鏈非編碼RNA，參與癌細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移等過程，在宮頸癌、結(jié)直腸癌、非小細(xì)胞肺癌以及食管鱗狀細(xì)胞癌等癌細(xì)胞中都表達(dá)上調(diào)[9-12]。Cai等發(fā)現(xiàn)，MALAT1在人骨肉瘤細(xì)胞和組織中都表達(dá)上調(diào)，而敲除MALAT1顯著抑制了骨肉瘤細(xì)胞的增殖和遷移，并誘導(dǎo)了細(xì)胞的周期阻滯和凋亡，這些結(jié)果表明MALAT1在骨肉瘤中有促癌的作用[13]。Ren等的研究表明MALAT1也參與了前列腺癌細(xì)胞的發(fā)展過程，發(fā)現(xiàn)MALATI-siRNA抑制了前列腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，并在G0/G1期誘導(dǎo)周期阻滯，可作為去勢抗性前列腺癌的潛在治療靶點(diǎn)[14]。Cyclin D1是周期蛋白家族成員之一，細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期需要Cyclin/CDK進(jìn)行調(diào)控[15]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)MALAT1過表達(dá)后細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)，且促進(jìn)了細(xì)胞從G0/G1期向S期轉(zhuǎn)換，進(jìn)一步檢測周期蛋白Cyclin D1表達(dá)，顯示MALAT1過表達(dá)組的Cyclin D1蛋白表達(dá)量顯著高于對照組，而干擾組降低，該結(jié)果說明MALAT1過表達(dá)促進(jìn)Cyclin D1高表達(dá)，從而促進(jìn)了細(xì)胞增殖。對細(xì)胞凋亡情況進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)MALAT1過表達(dá)組凋亡率降低，干擾組升高，MALAT1過表達(dá)組的抗凋亡因子Bcl-2高表達(dá)，而促凋亡因子Bax低表達(dá)，MALAT1表達(dá)干擾后結(jié)果相反，說明MALAT1過表達(dá)會(huì)抑制癌細(xì)胞凋亡，干擾MALAT1表達(dá)則促進(jìn)細(xì)胞凋亡。本研究還檢測了各組細(xì)胞p-ERK1/2蛋白相對表達(dá)量，結(jié)果顯示MALAT1過表達(dá)組高表book=416,ebook=34達(dá)p-ERK1/2，推測MALAT1促進(jìn)了ERK1/2信號(hào)通路的激活，進(jìn)而影響前列腺癌細(xì)胞的生物學(xué)行為發(fā)生變化。

圖6 MALAT1對PC3、LNCaP細(xì)胞克隆形成能力的影響Figure6 Effects of MALAT1 on clone formation of PC3 and LNCaP cells

圖7 MALAT1對Cyclin D1、Bcl-2、Bax及p-ERK1/2表達(dá)的影響Figure7 Effects of MALAT1 on expression of Cyclin D1, Bcl-2, Bax and p-ERK1/2

綜上所述，MALAT1過表達(dá)促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞的增殖，抑制凋亡，在前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要的作用。而干擾MALAT1的表達(dá)后，抑制了癌細(xì)胞的增殖，并促進(jìn)其凋亡，推測抑制MALAT1表達(dá)會(huì)對前列腺癌的治療具有非常重要的意義，但lcnRNA-MALAT1對前列腺癌的具體作用機(jī)制還需進(jìn)一步深入研究。

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