邱立強，夏豪，江洪，李雯靜，吳剛，羅強，徐昌武

眾所周知，動脈粥樣硬化是包括心肌梗死和腦卒中在內(nèi)的多種心腦血管疾病的病理基礎，而血管平滑肌細胞（VSMCs）的增殖和遷移在動脈粥樣硬化和血管再狹窄中起關(guān)鍵作用[1]。包括經(jīng)皮腔內(nèi)血管成形術(shù)、支架置入術(shù)等在內(nèi)的介入治療手段仍然是治療心腦血管疾病的主要選擇[2]。然而，因VSMCs遷移至內(nèi)膜并過度增殖而導致的血管再狹窄時常發(fā)生，并最終導致手術(shù)失敗[3]。研究表明核轉(zhuǎn)錄因子κB（NF-κB）介導的炎癥反應在血管內(nèi)再狹窄的發(fā)生和發(fā)展中起關(guān)鍵作用[4-5]。斑蝥素是我國傳統(tǒng)中藥斑蝥的主要活性成分，其對包括肺癌[6]、乳腺癌[7]以及黑色素瘤[8]等多種癌細胞的增殖和侵襲有顯著的抑制作用，其中黑色素瘤細胞發(fā)揮作用與抑制NF-κB信號通路活性有關(guān)。但斑蝥素在心腦血管疾病，尤其是與VSMCs功能密切相關(guān)的動脈粥樣硬化及血管再狹窄中是否也具有類似作用，一直以來卻鮮有報道。為此我們通過脂多糖誘導VSMCs增殖和遷移，觀察了斑蝥素對大鼠胸主動脈VSMCs增殖和遷移的作用以及對NF-κB信號通路的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

SD雄性大鼠（120～180 g），購自湖北省實驗動物研究中心；脂多糖、二甲基亞砜（DMSO）和斑蝥素購自美國Sigma公司；DMEM/F12培養(yǎng)基、1×磷酸鹽緩沖液（PBS，137 mmol/L氯化鈉、2.7 nmol/L氯化鉀和10 mmol/L 的 PBS，PH：7.3～7.5）購自美國HyClone公司；胎牛血清（FBS）購自杭州四季青公司；雙抗購自杭州吉諾公司；細胞毒性及增殖檢測試劑盒（CCK-8）購自日本株式會社同仁化學研究所；碘化丙啶（PI）購買于上海生工；酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒購自美國 ImmunoWay Biotechnology公司；4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）、BCA法蛋白濃度測定試劑盒、VSMCs表型標志蛋白（α-SM-actin）抗體及甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體購自碧云天生物技術(shù)研究所；NF-κB p65（p65）、磷酸化NF-κB p65（P-p65）、NF-κB 抑制蛋白（IκB-α）抗體均購自美國CST公司；熒光二抗購自美國LICOR 公司；Trizol購自南京AIDLAB公司；聚偏氟乙烯（PVDF）膜購自美國merck-millipore，脫脂奶粉購自武漢谷歌生物科技有限公司。

1.2 方法

大鼠胸主動脈VSMCs 的分離培養(yǎng)和鑒定：采用組織塊貼壁法培養(yǎng)原代大鼠胸主動脈VSMCs。原代培養(yǎng)用含15% FBS和1%雙抗的DMEM/F12培養(yǎng)基，2天換液1次。傳代后用含10% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)。用抗α-SM-actin抗體對VSMCs特異性的α-肌動蛋白進行免疫熒光染色鑒定，α-SM-actin陽性顯色率達到95%以上。第3～5代細胞用于實驗。

CCK-8檢測細胞活性和確定脂多糖使用濃度：如文獻[9]所述，具體步驟如下：（1）細胞活性檢測，將細胞以2.0×104個/孔的密度接種在96孔板中。待細胞融合至80%時，換無血清培養(yǎng)基饑餓處理24 h，再與不同劑量（0、1.25、2.50、5.00和10.00 μmol/L）的斑蝥素或0.1%的DMSO共孵育24 h，然后向每孔加入10 μl CCK-8試劑（使CCK-8試劑含量為10%）繼續(xù)培養(yǎng)2 h后，在酶標儀上（450 nm）測各孔的光密度（OD）值。（2）LPS使用濃度的確定，將細胞以2.0×104個/孔的密度接種在96孔板中。待細胞融合至60%時，換無血清培養(yǎng)基饑餓處理24 h，再與不同劑量（0、0.01、0.10、1.00、10.00和50.00 mg/L）的脂多糖共孵育24 h，然后向每孔加入10 μl CCK-8試劑（使CCK-8試劑含量為10%）繼續(xù)培養(yǎng)2 h后，在酶標儀上（450 nm） 測各孔的OD值。每組設6個復孔。

實驗分組：對照組、1 mg/L 脂多糖刺激組、脂多糖刺激后加用5 μmol/L斑蝥素組和脂多糖刺激后加用10 μmol/L斑蝥素組。

流式細胞儀檢測細胞增殖：如文獻[10]中所述，具體如下：將細胞接種于6 cm培養(yǎng)皿中，待細胞融合至60%左右時，饑餓處理24 h。后將各組培養(yǎng)基更換為含脂多糖和（或）相應濃度斑蝥素的1% FBS的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。接著用胰酶將細胞消化下來并離心，用PBS洗滌2次后加入預冷的70%的乙醇固定細胞并4℃過夜。取出細胞離心并用PBS洗滌細胞2次，然后加入0.4 ml PI稀釋液（含50 mg/L的PI和100 mg/L的RNase A）室溫避光孵育30 min，然后使用流式細胞儀（Becton Dickinson， 美國）檢測各組細胞周期分布情況，并計算出各組細胞處于G1期，S期，G2期的比例。

Transwell實驗檢測各組細胞遷移[11]：用含有或不含有相應濃度斑蝥素的培養(yǎng)基將細胞密度調(diào)整為5.0×108個/L，然后每組每孔取200 μl種植于上室，下室加入600 μl含15% FBS的培養(yǎng)基，添加或不添加脂多糖，于培養(yǎng)箱中孵育12 h后取出；并將小室用PBS小心沖洗3次，并用棉簽將小室內(nèi)面未穿過的細胞輕輕擦去；用4%的多聚甲醛室溫固定20 min后用PBS小心沖洗3次；然后將小室放入1 mg/L的DAPI中染色2 min，用PBS洗滌后在熒光顯微鏡（Olympus，日本）200倍下隨機選取6個視野并拍照，最后使用Image J 1.51w software（NIH， 美國）軟件計數(shù)穿過小室的細胞數(shù)。

蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測蛋白表達：蛋白抽提后，使用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定其蛋白濃度[12]，然后加入上樣緩沖液煮沸后備用。按每孔30 μg總蛋白于預先配置好的10%聚丙烯酰胺凝膠上電泳進行蛋白分離。然后電轉(zhuǎn)至預先活化好的PVDF膜上。電轉(zhuǎn)完成后用5%的脫脂奶粉室溫封閉2 h。PBST（1×PBS含0.1%的吐溫-20）洗滌3次后，分別與IκB-α、p65、P-p65、GAPDH一抗4℃孵育過夜。取出PVDF膜用PBST洗滌3次，再與熒光標記羊抗兔二抗室溫避光孵育1 h。取出PVDF膜，在避光環(huán)境下用PBST洗滌3次后使用Odyssey雙色近紅外激光成像系統(tǒng)（Li-Cor Biosciences， 美國）采集蛋白條帶圖像，測定灰度值通過校準GAPDH作為內(nèi)參進行半定量分析。

實時熒光定量聚合酶鏈式反應法（q-PCR）檢測腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-6（IL-6）和單核細胞趨化蛋白-1（MCP-1）的信使核糖核酸（mRNA）表達水平：采用Trizol提取細胞總核糖核酸（RNA）。用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（AMV，Promega公司）進行互補脫氧核糖核酸（cDNA）合成和擴增。相關(guān)基因的引物序列見表1。q-PCR法檢測各基因mRNA表達。

表1 基因及引物序列

ELISA法測定培養(yǎng)液中TNF-α、IL-6濃度：各組細胞經(jīng)脂多糖和（或）斑蝥素處理24 h后，收集各組細胞培養(yǎng)液后離心去除細胞碎片，按照ELISA試劑盒說明書操作，用酶標儀在450 nm 處測各組OD值。根據(jù)標準品的濃度和OD 值計算出標準曲線的回歸方程式，并計算出樣品中對應的濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品中TNF-α、IL-6實際濃度。

統(tǒng)計學方法：以SPSS 22.0統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計學分析。結(jié)果以均數(shù)±標準差或率表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較用t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

大鼠胸主動脈VSMCs鑒定以及斑蝥素對VSMCs活性的影響：VSMCs特異性的α-肌動蛋白免疫熒光染色結(jié)果顯示，α-SM-actin陽性顯色率達到95%以上（圖1），符合實驗要求。CCK-8結(jié)果（圖2A）顯示，與DMSO比較，不同濃度（1.25、2.50、5.00和10.00 μmol/L）斑蝥素處理后的細胞活性差異均未見統(tǒng)計學意義（P均＞0.05）；斑蝥素濃度在10 μmol/L及以下時，不會對細胞活性產(chǎn)生影響，故以下實驗斑蝥素劑量均不超過10 μmol/L。圖2B顯示，當脂多糖使用濃度為1 mg/L時VSMCs增殖能力顯著提高，但隨著脂多糖濃度的進一步增加其增殖能力增速減慢，故在本實驗中選擇脂多糖的濃度為1 mg/L。

圖1 大鼠VSMCs免疫熒光染色鑒定(×400)

圖2 CCK-8分析斑蝥素對大鼠VSMCs活性的影響以及脂多糖對VSMCs增殖的影響

斑蝥素對脂多糖誘導的VSMCs增殖的影響：圖3顯示，與對照組比較， 1 mg/L 脂多糖刺激組S期（藍色斜線區(qū)域）細胞明顯減少，而G2期（黃色區(qū)域）細胞占比明顯增多（P均＜0.01）。然而，與1 mg/L 脂多糖刺激組比較，脂多糖刺激后加用10μmol/L斑蝥素組S期（藍色斜線區(qū)域）細胞顯著增多（P＜0.01），G2期（黃色區(qū)域）細胞占比明顯減少（P＜0.05）。

圖3 流式細胞儀分析斑蝥素對脂多糖誘導的大鼠VSMCs增殖的影響

斑蝥素對脂多糖誘導的VSMCs遷移的影響：圖4顯示，與對照組比較，1 mg/L 脂多糖刺激組穿出小室的細胞數(shù)增加46.3%（P＜0.01）；而脂多糖刺激后加用5 μmol/L斑蝥素組和脂多糖刺激后加用10 μmol/L斑蝥素組穿出小室的細胞數(shù)分別較1 mg/L脂多糖刺激組減少72.0%和90.4%（P＜0.01）；與脂多糖刺激后加用5 μmol/L斑蝥素組比較，脂多糖刺激后加用10 μmol/L斑蝥素組穿出小室的細胞數(shù)減少 65.9%（P＜0.01）。

Western blot結(jié)果（圖 5） 顯示：IκB-α 作為NF-κB通路激活的抑制蛋白，在1 mg/L 脂多糖刺激組其表達較對照組顯著降低（P＜0.01），而加入斑蝥素后其表達隨著斑蝥素濃度的增加而升高（P＜0.05）；與脂多糖刺激后加用5 μmol/L斑蝥素組比較，脂多糖刺激后加用10 μmol/L斑蝥素組IκB-α表達進一步升高50.8%（P＜0.05）。P-p65水平在脂多糖作用后表達較對照組明顯增加（P＜0.05）；而經(jīng)斑蝥素處理后其表達呈濃度依賴性受到抑制（P均＜0.05）；而T-p65水平在脂多糖誘導以及經(jīng)斑蝥素處理后其表達差異均未見統(tǒng)計學意義（P均＞0.05）。

圖4 Transwell分析斑蝥素對脂多糖誘導的大鼠VSMCs遷移的影響

圖5 Western blot分析斑蝥素對大鼠VSMCs的NF-κB 信號通路相關(guān)蛋白影響

q-PCR和ELISA結(jié)果顯示：q-PCR結(jié)果（圖6A～C）顯示，與對照組比較，1 mg/L 脂多糖刺激組細胞內(nèi)TNF-α、IL-6、MCP-1 mRNA水平均顯著升高（P均＜0.05）；與1 mg/L 脂多糖刺激組比較，脂多糖刺激后加用5 μmol/L斑蝥素組和脂多糖刺激后加用10 μmol/L斑蝥素組TNF-α、IL-6、MCP-1 mRNA水平均明顯降低（P均＜0.05），另外與脂多糖刺激后加用5 μmol/L斑蝥素組比較，脂多糖刺激后加用10μmol/L斑蝥素組TNF-α、IL-6、MCP-1 mRNA水平較低，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。ELISA結(jié)果（圖6D～E）顯示，與對照組比較，1 mg/L 脂多糖刺激組TNF-α、IL-6濃度均有明顯升高（P均＜0.01），而脂多糖引起的TNF-α、IL-6濃度升高在斑蝥素處理后其濃度隨著斑蝥素濃度的增加而降低（P均＜0.05）。

圖6 q-PCR和ELISA測定斑蝥素對大鼠VSMCs促炎因子TNF-α、IL-6、MCP-1表達的影響

3 討論

心腦血管疾病是全世界因疾病造成死亡的主要原因，嚴重威脅人類生命健康[13-14]。心腦血管疾病介入治療雖在很大程度上改善了患者的預后，但支架置入引起的內(nèi)皮損傷可顯著促進白細胞、血小板和脂質(zhì)顆粒等局部聚集導致炎癥反應[15-16]。隨之，白細胞、內(nèi)皮細胞和VSMCs等產(chǎn)生促炎細胞因子，導致VSMCs增殖、遷移和細胞外基質(zhì)形成并最終導致再狹窄[17]。因此抑制血管炎癥反應，在治療血管再狹窄中具有重要意義。

斑蝥素是我國傳統(tǒng)中藥斑蝥的有效提取成分，是一種選擇性蛋白磷酸酶2A（PP2A）抑制劑[18]。PP2A 是細胞內(nèi)最重要的磷酸酶之一，參與調(diào)控包括細胞增殖和轉(zhuǎn)錄等在內(nèi)的多種重要的生理過程[19]。目前關(guān)于斑蝥素的研究主要集中在抗腫瘤方面，研究發(fā)現(xiàn)斑蝥素可抑制多種腫瘤細胞的增殖和侵襲，其發(fā)揮作用與抑制細胞內(nèi)NF-κB p65核轉(zhuǎn)位密切相關(guān)[20]。最近也有體外研究發(fā)現(xiàn)，斑蝥素可顯著抑制人臍血管內(nèi)皮細胞增殖，遷移和血管形成[18]。因此，我們推測斑蝥素與VSMCs過度增殖和遷移引起的血管再狹窄具有密切的聯(lián)系，而這種聯(lián)系與炎癥反應相關(guān)。本研究通過體外分離培養(yǎng)大鼠VSMCs，用斑蝥素處理經(jīng)脂多糖誘導炎癥反應的VSMCs，結(jié)果發(fā)現(xiàn)斑蝥素可顯著降低脂多糖誘導的VSMCs炎癥反應，并抑制VSMCs的增殖和遷移。

眾所周知，NF-κB信號通路在炎癥相關(guān)疾病中扮演著重要的作用。NF-κB由p50和p65兩個亞基組成。Landry等[21]發(fā)現(xiàn)，在大鼠頸動脈球囊損傷后p50和p65被激活，而它們的抑制性蛋白IκB-α水平顯著降低。事實上，抑制NF-κB信號通路激活可抑制VSMCs增殖和遷移，從而減少血管損傷后新生內(nèi)膜的形成[22]。這些結(jié)果與我們在體外研究結(jié)果基本一致。我們發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)的VSMCs在脂多糖刺激后其NF-κB信號通路顯著激活，其下游促炎因子包括TNF-α、 IL-6、MCP-1的表達顯著增加，細胞增殖和遷移能力也明顯增強；而在斑蝥素處理后胞內(nèi)NF-κB抑制性蛋白IκB-α表達增加，NF-κB p65磷酸化受阻，TNF-α、IL-6、MCP-1的表達降低，細胞增殖和遷移能力也隨之下降。這提示，斑蝥素可通過抑制NF-κB信號通路的激活而降低VSMCs的增殖和遷移能力。

總之，我們的實驗結(jié)果表明，斑蝥素可顯著抑制脂多糖誘導的VSMCs的增殖和遷移，而發(fā)揮作用的機制至少部分與斑蝥素抑制NF-κB信號通路激活有關(guān)。這為進一步研究斑蝥素對VSMCs生物學活性的作用奠定了基礎，為治療與VSMCs功能密切相關(guān)的動脈粥樣硬化及血管再狹窄提供了理論基礎。