韓琳琳, 李 斐, 李 艷, 吳 凡, 郁多男

(江蘇省非編碼RNA基礎(chǔ)與臨床轉(zhuǎn)化重點實驗室, 揚州大學(xué), 江蘇 揚州, 225001)

淋巴瘤是淋巴造血系統(tǒng)惡性腫瘤的總稱，其死亡率較高，患者預(yù)后差，發(fā)病率呈上升趨勢[1-2]。世界衛(wèi)生組織將淋巴瘤分為霍奇金淋巴瘤(HL)與非霍奇金淋巴瘤(NHL)。國際淋巴瘤研究組織又將淋巴瘤分為B細(xì)胞淋巴瘤、T細(xì)胞淋巴瘤和自然殺傷(NK)細(xì)胞淋巴瘤。目前, HL發(fā)病率較低，僅占10.9%, 且以每年3.0%～4.0%速率下降，而NHL發(fā)病率較高，占89.1%, 其中在兒童及青壯年比例較高。B細(xì)胞淋巴瘤是B細(xì)胞發(fā)生的實體腫瘤，約占惡性淋巴瘤的70.0%～80.0%[3], 其主要起源于淋巴組織生發(fā)中心的B細(xì)胞[4]。約40.0%的B細(xì)胞淋巴瘤存在染色體易位，這將導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[5]。

Myc是一種癌基因，位于染色體8q24上，它編碼蛋白C-Myc基因、L-Myc基因和N-Myc基因[6]。L-Myc作用較少, N-Myc可以在小鼠發(fā)育、細(xì)胞生長和分化中取代C-Myc功能，但N-Myc的表達(dá)具有組織限制性[7], 只有C-Myc基因在細(xì)胞的增殖、凋亡、蛋白質(zhì)合成、DNA復(fù)制及促進(jìn)血管形成等生物學(xué)過程中發(fā)揮著重要作用[8-9]。在伯基特淋巴瘤中, 90%以上出現(xiàn)Myc染色體的易位[11]。腫瘤的抑制是腫瘤抑制因子p53起著核心的作用[12], 而p53是一種轉(zhuǎn)錄因子，它可以通過調(diào)控其目標(biāo)基因的表達(dá)來發(fā)揮作用[13-14]。然而, p53可以被一些應(yīng)激信號激活，如有絲分裂的持續(xù)促進(jìn)和DNA的損傷。同時，p53的激活可以導(dǎo)致細(xì)胞周期的停滯，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡[15]; p53也可以通過抑制與細(xì)胞周期無關(guān)的調(diào)節(jié)，如抑制腫瘤血管的生成[16]。大多腫瘤的形成與p53功能的失活有關(guān)，它的失活主要見于基因的突變與病毒癌蛋白的相互作用。

本研究利用Myc可控表達(dá)且p53失活的原理建立了B細(xì)胞淋巴瘤小鼠模型，利用敲入的可編碼Myc和雌激素受體(ER)融合蛋白MycERTAM的等位基因，實現(xiàn)對Myc的“失活”與“激活”的調(diào)控[17], 現(xiàn)將研究結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與動物

1.1.1 細(xì)胞培養(yǎng): GP+E86包裝細(xì)胞受贈于美國賓夕法尼亞大學(xué)AndreiThomas-Tikhonenko實驗室, DMEM高糖, 10%胎牛血清, 10%雙抗, 37 ℃, 5% CO2培養(yǎng)。

1.1.2 質(zhì)粒的構(gòu)建: 以MIGR1為逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，成功構(gòu)建MIGR1-MycER的逆轉(zhuǎn)錄病毒。細(xì)胞轉(zhuǎn)染: 40 μL Lipofectamine 2000, 2 μg vsvg, 2 μg gagpol, 10 μg MIGR1-MycER, 混勻后室溫靜置10 min, 加入GP+E86細(xì)胞中，混勻后放入細(xì)胞培養(yǎng)箱過夜, 12 h后換液, 48 h后用新霉素(G418)篩選，細(xì)胞繼續(xù)擴(kuò)增培養(yǎng)。

1.1.3 小鼠皮下注射: p53敲除鼠和野生型C57BL/6小鼠雜交8代后，將小鼠脫臼處死，取小鼠四肢骨髓，用2 mL注射器吸取PBS沖洗出骨髓組織，與轉(zhuǎn)染了MIGR1-MycER的GP+E86細(xì)胞混勻。選取6～8周C57BL/6同源小鼠10只分組行皮下注射，觀察小鼠體內(nèi)腫瘤生長情況。

1.2 藥物

他莫昔芬粉末(Sigma, T5648)超聲溶解于玉米油(Sigma, C8267)中, 10 mg/mL。每日腹腔注射1次，每只小鼠1 mg。

1.3 流式細(xì)胞術(shù)

將小鼠脫臼處死后，取出骨髓組織, PBS洗滌2次，由于MIGR1-MycER攜帶綠色熒光蛋白(GFP), 骨髓內(nèi)的腫瘤細(xì)胞攜有GFP熒光蛋白，可通過流式細(xì)胞術(shù)檢測到Myc表達(dá)細(xì)胞。

2 結(jié) 果

2.1 Myc可調(diào)控的B細(xì)胞淋巴瘤小鼠模型的建立

將p53-null骨髓細(xì)胞與轉(zhuǎn)染了MIGR1-MycER的GP+E86細(xì)胞混勻，經(jīng)皮下注射到C57BL/6小鼠。由于此時Myc不能進(jìn)入細(xì)胞核而處于“失活”狀態(tài)，所以未見腫瘤形成。而在TAM腹腔注射后，Myc激活，進(jìn)而促進(jìn)了腫瘤的形成(圖1A)。將小鼠腫瘤取出后，用70 μm尼龍網(wǎng)研磨，紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞后，用CD19抗體標(biāo)記，流式檢測結(jié)果證實該腫瘤來源于B細(xì)胞淋巴瘤(圖1B)。

A: 小鼠模型實驗設(shè)計; B: 腫瘤細(xì)胞流式檢測結(jié)果

圖1 Myc可調(diào)控B細(xì)胞淋巴瘤小鼠模型的建立

2.2 MycER淋巴瘤小鼠模型的皮下腫瘤生長速度具有他莫昔芬(TAM)依賴性

C57BL/6小鼠皮下注射2×106個MycER B淋巴瘤細(xì)胞后，小鼠隨機(jī)分為3組: TAM+/+組，小鼠連續(xù)注射TAM, 腫瘤在第8天開始迅速變大; TAM+/-組，小鼠連續(xù)注射TAM, 到第8天停止TAM注射，腫瘤開始變小; 對照組小鼠未注射TAM, 則無腫瘤生長。見圖2A。第14天將TAM+/+組與TAM+/-組小鼠脫臼處死，取出腫瘤分別稱量, TAM+/+組小鼠腫瘤質(zhì)量顯著高于TAM+/-組(P<0.01)。見圖2B。上述結(jié)果表明, TAM注射后可使Myc入核，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。

A: TAM+/+組、TAM+/-組及對照組小鼠腫瘤體積變化，其中TAM+/+組為連續(xù)注射TAM, TAM+/-組為連續(xù)

注射TAM至第8天，對照組未注射TAM; B: TAM+/+組、TAM+/-組小鼠腫瘤質(zhì)量比較。與TAM+/-組比較, **P<0.01。

圖2 Myc調(diào)控B細(xì)胞淋巴瘤生長的作用

2.3 MycER淋巴瘤小鼠模型的全身性腫瘤細(xì)胞生長速度具有TAM依賴性

C57BL/6小鼠隨機(jī)分為2組，每組5只，將2×106個MycER細(xì)胞注射到鼠尾靜脈。熒光顯微鏡下觀察TAM+/+與TAM+/-淋巴瘤細(xì)胞的生長情況。連續(xù)2周注射TAM后(TAM+/+), 取出小鼠骨髓，用70 μm尼龍網(wǎng)研磨，PBS洗滌2次，倒置顯微鏡下可見大量綠色熒光細(xì)胞(圖3A)，連續(xù)注射TAM到第8天停止TAM注射(TAM+/-)的小鼠骨髓幾乎未見GFP陽性細(xì)胞(圖3B), 流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果進(jìn)一步驗證此結(jié)果(圖3C)。上述結(jié)果表明，腹腔注射TAM可以使Myc入核，促使淋巴瘤細(xì)胞生長，而停止注射TAM后, Myc無法入核，淋巴瘤細(xì)胞幾乎停止生長。

A、B: 使用倒置熒光顯微鏡觀察TAM+/+或TAM+/-的小鼠骨髓細(xì)胞，普通相差與綠色熒光是相同的觀察視野;C: 流式細(xì)胞術(shù)分析TAM+/+或TAM+/-小鼠腫瘤細(xì)胞在骨髓中的比例

圖3 TAM對MycER腫瘤細(xì)胞在骨髓中增殖的影響

除了觀察骨髓中腫瘤細(xì)胞的生長是否依賴Myc作用之外，作者還通過組織學(xué)觀察了小鼠主要臟器中腫瘤細(xì)胞的生長情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)腹腔持續(xù)注射TAM(TAM+/+)后小鼠主要臟器均有大量腫瘤細(xì)胞的生長，表現(xiàn)為肝、脾、淋巴結(jié)、肺、腎依次為()、()、()、(+)、(+), 其中()代表腫瘤細(xì)胞占據(jù)整個臟器的40%以上, ()代表腫瘤細(xì)胞占據(jù)整個臟器的30%以上, (+)代表腫瘤細(xì)胞占據(jù)整個臟器的10%以上。連續(xù)注射TAM到第8天后停止TAM注射(TAM+/-)小鼠主要臟器未觀察到明顯的腫瘤細(xì)胞存在。

2.4 MycER誘導(dǎo)的B細(xì)胞淋巴瘤可以不依賴于Myc而繼續(xù)生長

為了更好的研究腫瘤生長動力學(xué)，作者將2×106個腫瘤細(xì)胞注射到C57BL/6小鼠皮下，并將其分為2組，每組3只小鼠, TAM+/+組小鼠進(jìn)行TAM腹腔注射，腫瘤體積迅速增大; TAM+/-組小鼠連續(xù)腹腔注射TAM到第8天后停用，腫瘤體積逐漸變小，并停止生長，但3周后即使未注射TAM，腫瘤又重新生長。本實驗重復(fù)至少3次，上述結(jié)果說明此種情況下，腫瘤的復(fù)發(fā)可以不依賴于Myc的作用。見圖4。

TAM+/+組小鼠進(jìn)行TAM腹腔注射,腫瘤體積迅速增大; TAM+/-組小鼠連續(xù)腹腔注射TAM到第8天后停用,腫瘤體積逐漸變小,但3周后即使未注射TAM, 腫瘤又重新生長。圖4 MycER腫瘤細(xì)胞的生長可以不依賴于Myc的作用

2.5 TAM+/-組小鼠重新注射TAM后瘤體急劇生長

將2×106個腫瘤細(xì)胞注射到C57BL/6小鼠皮下，并將其分為3組，每組2只小鼠。TAM+/+組小鼠連續(xù)腹腔注射TAM, 腫瘤體積迅速增大; TAM+/-組小鼠于第8天停止腹腔注射TAM, 腫瘤逐漸變小，但22 d左右開始緩慢生長; TAM+/-/+組小鼠于TAM第8天停止注射，腫瘤體積也逐漸變小，但于第22天恢復(fù)腹腔注射TAM, 腫瘤體積急劇變大。本實驗重復(fù)至少3次，上述結(jié)果說明MycER淋巴瘤細(xì)胞的生長盡管可以不依賴于Myc的作用，但Myc仍然可以使腫瘤的生長速度增加，而且與原發(fā)腫瘤的生長作用相比, Myc對復(fù)發(fā)瘤的作用更明顯。見圖5。

TAM+/+組小鼠連續(xù)腹腔注射TAM, 腫瘤體積迅速增大; TAM+/-組小鼠于第8天停止腹腔注射TAM, 腫瘤逐漸變小,但22 d左右開始緩慢生長; TAM+/-/+組小鼠于TAM第8天停止注射,腫瘤體積也逐漸變小,但于第22天恢復(fù)腹腔注射TAM, 腫瘤體積急劇變大。圖5 TAM的不同注射情況對MycER腫瘤生長情況的影響

3 討 論

Myc作為一種癌基因，它易位到免疫球蛋白增強(qiáng)子下游是伯基特淋巴瘤形成的標(biāo)志性分子生物學(xué)特征[18]。Myc可以調(diào)控約15%的人類基因[19]。Myc的表達(dá)與多種調(diào)控機(jī)制密切相關(guān)，包括位于啟動子區(qū)域基序的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)[20-21]。

本實驗室建立了MycER/p53-null的B細(xì)胞淋巴瘤的小鼠模型，用TAM實現(xiàn)Myc“開”與“關(guān)”的兩種狀態(tài)的調(diào)控。作者將MycER逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝細(xì)胞與p53敲除小鼠骨髓細(xì)胞混合后注射到C57BL/6小鼠皮下，此時被MycER感染的骨髓細(xì)胞中的Myc不能入核，所以未見腫瘤出現(xiàn)。當(dāng)腹腔持續(xù)注射TAM時, Myc入核，發(fā)揮促癌作用，腫瘤開始生長; 而當(dāng)TAM撤離后腫瘤生長立即停止, 3～4周后腫瘤又開始重新生長。這些重新生長的腫瘤細(xì)胞(“逃逸者”)是不依賴于Myc的調(diào)控，但是再次給予TAM可導(dǎo)致腫瘤生長急劇加速，體積比原發(fā)腫瘤更大。這種再生長的腫瘤細(xì)胞雖然不依賴于Myc的生長，但是對Myc更加敏感。

目前，越來越多的科學(xué)家研究B細(xì)胞淋巴瘤的發(fā)病機(jī)制及治療方法，但仍未見有效、可靠的治療策略。雖然臨床上應(yīng)用抗CD20單克隆治療B細(xì)胞淋巴瘤有一定的效果，但不是所有的患者對利妥昔單抗治療敏感，因此迫切需要新的靶向治療方法[22]。本課題成功建立了B淋巴瘤小鼠模型，此模型不僅具有人類伯基特淋巴瘤的分子與病理特征，還可自主調(diào)控Myc的活性，為臨床研究B細(xì)胞淋巴瘤的相關(guān)機(jī)制及作用靶點提供了有效的模型。