劉 淼, 范平生, 張騰躍, 黃 金, 樊高飛, 劉亞貝

(安徽省腫瘤醫(yī)院, 中國科學技術大學附屬第一醫(yī)院,中國科學技術大學 生命科學與醫(yī)學部, 安徽 合肥, 230000)

目前，早期肺癌仍缺乏有效的診斷手段，大多數(shù)肺癌患者初診時已為中、晚期，錯過了根治性治療的機會[1]。采用靶向治療、化學治療、放射治療、免疫治療等手段能使肺癌患者獲益，但仍有許多無靶向治療指征的肺癌患者因腫瘤耐藥性的產(chǎn)生而對化療不敏感，最終導致肺癌治療失敗。多年來，本課題組通過改善維拉帕米給藥途徑而顯著提高了晚期肺癌在內(nèi)的多種實體腫瘤的治療療效，但具體機制尚不完全明確[2-4]。本課題組發(fā)現(xiàn)在肺腺癌細胞中，維拉帕米可以有效逆轉順鉑耐藥，并發(fā)現(xiàn)鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)參與維拉帕米逆轉肺腺癌細胞耐藥的過程，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 一般材料

肺腺癌細胞株A549購自中國科學院細胞庫; 胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶、DMEM培養(yǎng)基購自GIBCO公司; CCK-8試劑盒、Annexin V-FITC/PI試劑盒購自碧云天生物技術公司, CaMKⅡ及P-CaMKⅡ抗體購自Abcam公司; HRP二抗和β-actin抗體購自Sigma公司，順鉑(DDP, 江蘇豪森, 30 mg/支)及維拉帕米(verapamil, 上海禾豐制藥, 5 mg, 2 mL)購自安徽省腫瘤醫(yī)院。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng): 肺腺癌細胞A549培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基(含青霉素G鈉和鏈霉素各100 U/mL), 37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。用0.25%胰蛋白酶消化細胞，進行傳代或接種于孔板培養(yǎng)。

1.2.2 Cell Counting Kit-8(CCK-8)法檢測細胞增殖: 取對數(shù)生長的A549接種到96孔板，約1×104細胞/孔，細胞貼壁后進行藥物處理。實驗分為正常組、維拉帕米組、順鉑單藥組(DDP)、順鉑聯(lián)合維拉帕米組(DDP+VER)。維拉帕米藥物濃度4.91 μg/mL, 順鉑濃度1.00 μg/mL。每組設置3個復孔，并設陰性對照，藥物作用48 h后加入CCK-8試劑(10.00 μL/孔)，作用1 h后用酶標儀進行檢測(Bio-Rad680)。藥物對細胞的抑制率(IR)=(OD空白-OD實驗)/OD空白×100%, OD為吸光度值。

1.2.3 Annexin V-FITC/PI雙染檢測細胞凋亡: 取對數(shù)生長的A549細胞接種于6孔板，藥物分組及濃度同1.2.2內(nèi)容。藥物作用48 h后收集各組細胞重懸于500.00 μL的Binding Buffer中，依次加入Annexin V-FITC 5.00 μL和 PI 5.00 μL, 室溫避光孵育，流式細胞儀上機檢測(參照碧云天生物公司Annexin V-FITC/PI雙染試劑盒說明書)。

1.2.4 Western blotting檢測蛋白表達水平: 藥物分組及濃度同1.2.2內(nèi)容。將培養(yǎng)板內(nèi)培養(yǎng)基棄去，冰PBS清洗后再次棄去，加入細胞裂解液于冰上裂解，充分刮離細胞并移入EP管內(nèi)，置于100 ℃金屬浴鍋內(nèi)10 min, 以標準血清蛋白為標準品測定蛋白濃度。使用聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白，半干轉至聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜), 5%脫脂奶粉室溫封閉 1 h, 加入一抗(稀釋比例: β-actin為1∶4 000; CaMKⅡ及P-CaMKⅡ為1∶1 000), 4 ℃孵育過夜, PBST洗滌后加二抗(1∶1 000)溫育2 h, 加 ECL于化學發(fā)光成像系統(tǒng)(ChemiScope 3600 Mini)進行成像。

1.3 統(tǒng)計學處理

應用SPSS 19.0進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學分析，計量資料采用均數(shù)±標準差表示，比較采用獨立樣本t檢驗;P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 維拉帕米逆轉肺腺癌細胞順鉑化療耐藥的效果

A549細胞系在單藥阿霉素組、阿霉素聯(lián)合維拉帕米組中的抑制率分別為(55.00±2.60)%和(32.30±1.80)%, 差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。2組與對照組相比均有顯著差異(P<0.05)。見圖1。

NC為正常組, VER為維拉帕米組, DDP為順鉑單藥組, DDP+VER為順鉑聯(lián)合維拉帕米組。與DDP+VER比較, *P<0.05。圖1 維拉帕米逆轉肺腺癌細胞順鉑化療耐藥的效果

2.2 維拉帕米促進肺腺癌細胞順鉑化療凋亡

在A549細胞中，單藥順鉑的凋亡率為10.30%, 順鉑聯(lián)合維拉帕米為21.60%, 差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖2。

DDP組

DDP+VER組

圖2 維拉帕米促進肺腺癌細胞順鉑化療凋亡

2.3 Western blotting檢測蛋白表達水平

在A549細胞中，順鉑聯(lián)合維拉帕米組中P-CaMKⅡ/CaMKⅡ的表達明顯低于單藥順鉑組。鑒于CaMKⅡ已被證實參與眾多腫瘤相關的信號傳導通路，作者測定了單藥化療組及聯(lián)合組中P-CaMKⅡ/CaMKⅡ蛋白活性水平，結果證實聯(lián)合藥物組中P-CaMKⅡ/CaMKⅡ蛋白表達低于化療單藥組。見圖3。

NC為正常組, VER為維拉帕米組, DDP為順鉑單藥組, DDP+VER為順鉑聯(lián)合維拉帕米組。圖3 各組P-CaMKⅡ、CaMKⅡ、β-actin的表達

3 討 論

姑息化療是治療晚期非小細胞肺癌患者的有效方法。與單純支持治療相比，使用含鉑類的聯(lián)合化療可有效提高生存率，改善生活質(zhì)量。由于肺癌細胞對化療藥物的天然或繼發(fā)的耐受性，使得相當部分患者發(fā)生嚴重的不良反應，且未取得實質(zhì)的治療效果。目前認為與腫瘤耐藥相關的機制主要包括ABC轉運蛋白的跨膜轉運、細胞解毒能力的增強、DNA損傷修復系統(tǒng)失調(diào)及凋亡相關通路受阻等[5]。

維拉帕米可以逆轉多種腫瘤細胞對化學藥物的耐藥性。體外研究[6]發(fā)現(xiàn)，維拉帕米有效逆轉腫瘤耐藥的濃度是6.00～10.00 μmol/L, 但維拉帕米的靜脈安全濃度是1.00～2.00 μmoL/L, 超過安全濃度會導致竇性心動過緩、房室傳導阻滯等嚴重的毒副作用。維拉帕米作為鈣離子阻滯劑，其靜脈應用時有誘發(fā)新的心臟疾病的風險。本課題組通過改變維拉帕米的給藥途徑(動脈介入化療、腹腔化療)并與化療藥物聯(lián)合應用，大大提高臨床療效，且未出現(xiàn)明顯的心臟惡性事件，但仍有部分患者療效欠佳[7-8], 這更加需要了解其逆轉耐藥的機制，尋找有效的預測分子。

CaMKⅡ是鈣信號下游的一種多功能絲/蘇氨酸蛋白激酶，存在4種不同基因亞型。Ca2+能與鈣調(diào)蛋白(CaM)結合，形成的鈣調(diào)蛋白復合物能夠促進鈣調(diào)蛋白與CaMKⅡ結合，從而使CaMKⅡ構象發(fā)生改變，引起酶的活化，調(diào)節(jié)不同細胞的生長。相關研究[9]表明α和β亞型在神經(jīng)細胞的發(fā)育及功能活性中發(fā)揮重要作用，γ亞型在免疫系統(tǒng)尤其是T細胞記憶、CD8+細胞活化中發(fā)揮重要的作用[10], 而δ亞型的研究主要集中在調(diào)節(jié)心肌細胞的穩(wěn)態(tài)和功能[11]。最近研究[12-13]表明, CaMKⅡ活化包括離子通道、激酶、轉錄因子在內(nèi)的約40種蛋白質(zhì)，從而在多種腫瘤細胞的增殖、分化、侵襲、轉移中發(fā)揮重要的作用。CaMKⅡ各種亞型在非小細胞肺癌、胃癌、肝癌、乳腺癌、骨肉瘤等惡性腫瘤中過表達，且與其臨床病理參數(shù)密切相關[14-17]。研究[18-19]表明CaMKⅡ能夠通過調(diào)控腫瘤干細胞的生長及分化，進而在腫瘤復發(fā)、治療抵抗等方面發(fā)揮重要的作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，在A549細胞中，維拉帕米能提高肺癌細胞中順鉑的抗癌能力，其抑制率及促進凋亡能力均顯著高于順鉑單藥組(P<0.05)。同時，維拉帕米聯(lián)合順鉑組中P-CaMKⅡ/CaMKⅡ低于順鉑單藥組，推測CaMKⅡ參與了維拉帕米逆轉化療耐藥的過程，但具體機制仍需進一步的探討。