王曉華 張玉娟

子宮內(nèi)膜癌是常見的婦科惡性腫瘤，發(fā)病率逐年上升。早期腫瘤患者經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化手術(shù)治療后預(yù)后較好，晚期或復(fù)發(fā)患者預(yù)后較差[1]。子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生、發(fā)展與腫瘤細胞的異常增殖和凋亡受阻密切相關(guān)[2]。凋亡蛋白抑制因子(inhibitor of apoptosis proteins, IAPs)是一類重要的抗細胞凋亡因子，具有調(diào)節(jié)細胞周期、抑制凋亡蛋白酶(caspase)活性的作用。Livin是目前發(fā)現(xiàn)的IAPs家族中活性最強的抗凋亡因子。研究發(fā)現(xiàn)，Livin在膀胱癌[3]、腎癌[4]、前列腺癌[5]、胃癌[6]、肺癌[7]等多種惡性腫瘤組織中特異性高表達。Livin在子宮內(nèi)膜癌中的表達及其對腫瘤細胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響目前尚不明確。本研究通過檢測Livin在不同子宮內(nèi)膜組織中的表達，研究Livin在子宮內(nèi)膜癌發(fā)生、發(fā)展中的作用，將Livin的小分子干擾RNA(Livin-siRNA)轉(zhuǎn)染人子宮內(nèi)膜癌Ishikawa和HEC-1-A細胞，觀察靶向干擾Livin對子宮內(nèi)膜癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 選取承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院婦科2015年3月—2016年10月手術(shù)切除的子宮內(nèi)膜標(biāo)本共118例，其中子宮內(nèi)膜癌組織62例，非典型增生內(nèi)膜組織26例，正常子宮內(nèi)膜組織30例。標(biāo)本采集經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，患者均簽署知情同意書。其中子宮內(nèi)膜癌患者術(shù)前均未接受放射、化學(xué)治療和激素治療，均經(jīng)病理學(xué)檢查確診，標(biāo)本離體后迅速放入液氮中保存，備行熒光定量PCR檢測。

1.2 細胞株和試劑 人子宮內(nèi)膜癌Ishikawa和HEC-1-A細胞(承德醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)研究所凍存)。Livin-siRNA、Livin陰性對照(Livin-NC)序列(蘇州吉瑪公司)，F(xiàn)BS、PRMI 1640培養(yǎng)基(美國Gibco公司)，Lipofectamine 2000、熒光定量PCR試劑盒(美國Invitrogen公司)，TRIzol(美國Ambion公司)，反轉(zhuǎn)錄PCR試劑盒(聯(lián)科生物公司)，Transwell小室(美國Corning公司)，Matrigel基質(zhì)膠(美國BD公司)。

1.3 主要儀器 CO2恒溫培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)，倒置顯微鏡(日本Olympus公司)，紫外分光光度儀(美國CKMAN Coulter公司)，熒光定量PCR儀(美國Bio-Rad公司)，SORVALL Biofuge fresco冷凍離心機(德國Kendro Labrotary公司)，電腦三橫高壓電泳儀RDY-1000A(北京榮陽經(jīng)典科技有限公司)。

1.4 熒光定量PCR檢測Livin mRNA表達 采用TRIzol法提取組織總RNA，應(yīng)用紫外分光光度儀鑒定其純度，以1 μL RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄合成互補DNA(cDNA)第1條鏈，應(yīng)用熒光定量PCR試劑盒進行熒光定量PCR反應(yīng)。目的基因Livin和管家基因GAPDH引物由大連寶生物公司設(shè)計合成。Livin正向引物為5’-ACG GAG CAT GCC AAG TGG T-3’，Livin反向引物為5’-CTG CAC ACT GTG GAC AAA GTC TCT-3’(擴增片段78 bp)；GAPDH正向引物為5’-GCA CCG TCA AGG CTG AGA AC-3’，GAPDH反向引物為5’-TGG TGA AGA CGC CAG TGG A-3’(擴增片段138 bp)。反應(yīng)條件：94 ℃ 2 min，94 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min共40個循環(huán)。每樣本設(shè)3個復(fù)孔，實驗重復(fù)5次。采用2-△△Ct法進行相對定量分析。

1.5 細胞轉(zhuǎn)染 將液氮中凍存的Ishikawa和HEC-1-A細胞復(fù)蘇，常規(guī)培養(yǎng)在含10%FBS的PRMI 1640培養(yǎng)基中，取對數(shù)生長期細胞用于實驗。實驗分為ISK-I組和HEC-I組(均轉(zhuǎn)染Livin-siRNA)、ISK-NC組和HEC-NC組(均轉(zhuǎn)染Livin-NC)、ISK-B組和HEC-B組(均僅以10%FBS培養(yǎng)細胞)。按照Lipofectamine 2000說明書配制轉(zhuǎn)染試劑，采用脂質(zhì)體法將Livin-siRNA和Livin-NC序列瞬時轉(zhuǎn)染Ishikawa和HEC-1-A細胞。

1.6 Western印跡檢測Livin蛋白的表達 轉(zhuǎn)染后48 h，收集各組蛋白質(zhì)，采用BCA法蛋白質(zhì)定量后，取40 μg進行凝膠電泳實驗。以封閉液封閉2 h，一抗(1∶1 000)于4 ℃孵育過夜，二抗(1∶3 000)孵育1 h。ECL發(fā)光液顯影后應(yīng)用天能6100圖像分析系統(tǒng)進行成像和定量分析，計算目的蛋白質(zhì)Livin/內(nèi)參蛋白質(zhì)β-actin的相對表達量。實驗重復(fù)5次。

1.7 Transwell小室檢測細胞侵襲和遷移能力 侵襲實驗：將Matrigel基質(zhì)膠與PRMI 1640培養(yǎng)基按1∶8比例混勻，每個小室以100 μL混合液均勻包被小室基底膜。收集轉(zhuǎn)染48 h的各組細胞，PRMI 1640培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細胞密度至5×105/mL，每孔上室加入100 μL單細胞懸液，下室加入500 μL含20% FBS培養(yǎng)基，置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。擦凈Matrigel基質(zhì)膠和上室的細胞，甲醇固定，0.1%結(jié)晶紫染色后取下微孔濾膜，樹膠封片。顯微鏡下隨機計數(shù)6個視野細胞數(shù)量取其平均值，每組3個小室，實驗重復(fù)2次。遷移實驗：小室不用鋪Matrigel基質(zhì)膠，在CO2培養(yǎng)箱中的培養(yǎng)時間為36 h，其余操作同侵襲實驗。

2 結(jié) 果

2.1 子宮內(nèi)膜癌組織臨床病理特征 62例子宮內(nèi)膜癌患者的平均年齡為(54.8±4.7)歲，其中年齡<60歲38例，≥60歲24例；肌層浸潤深度<1/2 44例，≥1/2 18例；病理分級G1級46例，G2級10例，G3級6例；依據(jù)國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(FIGO)2009年手術(shù)病理分期，Ⅰ或Ⅱ期54例，Ⅲ或Ⅳ期8例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移11例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移51例。

2.2 Livin mRNA在子宮內(nèi)膜癌組織中的表達 Livin mRNA在子宮內(nèi)膜癌組織中的相對表達量(8.624±0.264)顯著高于非典型增生組織(3.497±0.186)和正常內(nèi)膜組織(1.000±0.098，P值均<0.05)。

2.3 Livin表達與子宮內(nèi)膜癌臨床病理特征的關(guān)系 Livin mRNA在年齡<60歲與≥60歲的患者中的相對表達量分別為8.314±0.156和8.336±0.117，在肌層浸潤深度<1/2與≥1/2的患者中的相對表達量分別為6.392±0.149、9.227±0.216，在病理分級為G1級與G2+G3級的患者中的相對表達量分別為7.068±0.103和9.392±0.125，在FIGO分期為Ⅰ或Ⅱ期與Ⅲ或Ⅳ期的患者中的相對表達量分別為8.296±0.214和8.913±0.207，在有或無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者中的相對表達量分別為8.494±0.256和9.124±0.118。組間比較結(jié)果顯示，Livin mRNA僅在不同肌層浸潤深度(t=7.325，P=0.016)和不同病理分級(t=5.578，P=0.027)的患者間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.4 轉(zhuǎn)染后Livin蛋白表達 轉(zhuǎn)染后48 h，ISK-I組(0.395±0.012)和HEC-I組(0.514±0.022)的Livin蛋白相對表達量分別顯著低于ISK-NC組(1.108±0.048)、HEC-NC組(1.426±0.062)、ISK-B組(1.164±0.054)和HEC-B組(1.448±0.071，P值均<0.05)，見圖1。

2.5 干擾Livin對細胞侵襲和遷移能力的影響 侵襲實驗結(jié)果顯示，ISK-I組[(20.2±3.6)個]和HEC-I組[(28.8±3.2)個]的穿膜細胞數(shù)分別顯著少于ISK-NC組[(42.8±4.2)個]和HEC-NC組[(56.7±3.8)個，P值均<0.05]，見圖2。遷移實驗結(jié)果顯示，ISK-I組[(22.5±2.2)個]和HEC-I組[(30.8±2.4)個]的穿膜細胞數(shù)分別顯著少于ISK-NC組[(52.8±3.6)個]和HEC-NC組[(58.9±4.5)個，P值均<0.05],見圖3。

1 ISK-B組 2 ISK-NC組 3 ISK-I組 4 HEC-B組 5 HEC-NC組 6 HEC-I組圖1 轉(zhuǎn)染后Livin蛋白表達的電泳圖

A ISK-NC組 B ISK-I組 C HEC-NC組 D HEC-I組圖2 侵襲實驗結(jié)果(0.1%結(jié)晶紫染色，×200)

A ISK-NC組 B ISK-I組 C HEC-NC組 D HEC-I組圖3 遷移實驗結(jié)果(0.1%結(jié)晶紫染色，×200)

3 討 論

Livin作為IAPs家族成員，在腫瘤發(fā)生、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、自然免疫等多方面發(fā)揮作用[8]。Chen等[9]的研究發(fā)現(xiàn)，Livin在食管癌組織中的陽性表達與腫瘤分期有關(guān)。Liang等[10]應(yīng)用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測Livin在59例胃癌組織中的表達，結(jié)果顯示Livin的陽性率為52.5%，且Livin的表達與肌層浸潤深度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均有關(guān)。Wang等[11]通過研究Livin在結(jié)直腸腺癌、腺瘤和正常黏膜組織中的表達，發(fā)現(xiàn)Livin在結(jié)直腸正常黏膜組織中不表達，而在腺瘤的隱窩、結(jié)直腸癌的癌變上皮中均有表達，提示Livin在結(jié)直腸癌的發(fā)生中起到一定作用。Ye等[12]的研究發(fā)現(xiàn)，Livin在前列腺癌組織中高表達，并通過調(diào)節(jié)細胞G1/S期促進細胞增殖，推測Livin可能在前列腺癌的發(fā)生和細胞增殖方面起重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)，Livin在子宮內(nèi)膜癌組織中表達上調(diào)，熒光定量PCR結(jié)果提示Livin表達與肌層浸潤深度和病理分級有關(guān)，而與患者的年齡、FIGO分期和有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)。提示，Livin可能參與了子宮內(nèi)膜癌的惡性演進過程，在子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮了一定作用。

腫瘤的浸潤轉(zhuǎn)移導(dǎo)致多種信號通路和通路上多基因激活狀態(tài)發(fā)生改變，從而使得腫瘤細胞具有轉(zhuǎn)移的潛能[13]。張生軍等[14]的研究發(fā)現(xiàn)，沉默Livin基因的表達可使胃癌SGC7901細胞體外侵襲和遷移能力明顯降低。Cho等[15]應(yīng)用RNA干擾技術(shù)抑制Livin基因在肝癌HepG2細胞中的表達，發(fā)現(xiàn)HepG2細胞的侵襲和遷移能力顯著下降。Myung等[16]在研究Livin對大腸癌SW480和DK01兩種細胞生物學(xué)行為的影響時發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用RNA干擾技術(shù)抑制Livin基因的表達，可顯著抑制兩種結(jié)直腸癌細胞的浸潤和轉(zhuǎn)移能力，而過表達Livin則可促進細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。本研究采用脂質(zhì)體法將Livin-siRNA轉(zhuǎn)染人子宮內(nèi)膜癌Ishikawa和HEC-1-A細胞，Transwell小室侵襲和遷移實驗結(jié)果均顯示，轉(zhuǎn)染后兩種內(nèi)膜癌細胞的穿膜細胞數(shù)均顯著減少，說明干擾Livin表達可抑制Ishikawa和HEC-1-A細胞的侵襲和遷移能力，Livin在子宮內(nèi)膜癌的侵襲和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮了一定作用，與上述研究結(jié)果相符。

綜上所述，Livin在惡性腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮一定作用，可將其作為腫瘤的預(yù)測因子進行深入研究，但其預(yù)測價值尚需前瞻性、多中心研究的進一步證實。