常允建 康冉 薛璇 王韶暢 趙慶文 郭志云

（1. 西南交通大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，成都 610031；2. 大同市第二人民醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，大同 037000）

原發(fā)性肝癌的發(fā)病率居全球第5位，致死率排第 3 位，其中以肝細(xì)胞癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）最為常見［1］。生物分子間彼此相互作用形成的網(wǎng)絡(luò)體系是生物進(jìn)程運(yùn)行的基礎(chǔ)。網(wǎng)絡(luò)的失調(diào)是導(dǎo)致多種疾病尤其是腫瘤等重大疾病的根本原因。在這些網(wǎng)絡(luò)模體中最為普遍與重要的是前饋環(huán)路（Feed-forward loops，F(xiàn)FLs）［2］。FFL 由兩個輸入調(diào)節(jié)因子P1與P2，以及P1與P2共同調(diào)節(jié)的靶因子P3組成。FFL分連貫FFL（Coherent FFL）與非連貫FFL（Incoherent FFL）兩類［3］。連貫FFL指P1調(diào)控P2、P3和P2調(diào)控P3均為正向（Positive）調(diào)控，而非連貫FFL是指P1調(diào)控P2、P3為正向，而P2調(diào)控P3為負(fù)向（Negative）調(diào)控。

增強(qiáng)子（Enhancer）一般是幾百堿基對長度的DNA片段，并能被多個轉(zhuǎn)錄因子占據(jù)，在基因調(diào)控中通過順式調(diào)控原件對靶基因起正調(diào)控作用。已有研究表明肝細(xì)胞癌中的增強(qiáng)子突變會導(dǎo)致增強(qiáng)子失活，進(jìn)而影響靶基因的表達(dá)［4］。MicroRNA（miRNA）是一類長度為18-24 nt的非編碼小RNA，在進(jìn)化過程中高度保守，它通過與靶基因的3'UTR區(qū)特異性結(jié)合從而在轉(zhuǎn)錄后水平抑制靶基因的表達(dá)或直接降解靶mRNA，異常表達(dá)的miRNA在肝癌的發(fā)病機(jī)制中起重要作用。先前研究發(fā)現(xiàn)，增強(qiáng)子調(diào)控miRNA參與腫瘤的發(fā)生與發(fā)展，從而使得增強(qiáng)子、miRNA與轉(zhuǎn)錄因子可形成重要的調(diào)控單位FFL［5］。那么增強(qiáng)子與miRNA是否可以形成FFL目前還并不清楚。本課題組通過生物信息學(xué)手段進(jìn)行了增強(qiáng)子調(diào)控miRNA的識別，并篩選了其參與的FFL，對已通過實驗驗證的miRNA靶基因分析，基因注釋后發(fā)現(xiàn)上述的FFL參與多種與肝癌相關(guān)的信號通路或生物進(jìn)程。本研究旨在通過對FFL的識別與分析為以FFL為網(wǎng)絡(luò)模體單元的肝腫瘤調(diào)控機(jī)制以及肝腫瘤標(biāo)志物識別方面奠定前期工作基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 HepG2細(xì)胞系中增強(qiáng)子的識別

從ENCODE［6］數(shù)據(jù)庫下載得到HepG2細(xì)胞系的DNase高敏位點以及H3K4me1、H3K27ac、H3K4me3三類組蛋白修飾信息的ChIP-seq數(shù)據(jù)，根據(jù)增強(qiáng)子特征性的組蛋白修飾信號預(yù)測HepG2細(xì)胞系中的增強(qiáng)子。識別增強(qiáng)子區(qū)域基于如下特征［7-8］：（1）增強(qiáng)子區(qū)域中心位置存在DNase高敏位點；（2）在增強(qiáng)子區(qū)域內(nèi)存在明顯的H3K4me1和H3K27ac信號，且呈峰-谷-峰的趨勢；（3）增強(qiáng)子區(qū)域內(nèi)的H3K4me1信號比H3K4me3信號強(qiáng)。

1.2 HepG2細(xì)胞系中轉(zhuǎn)錄因子-增強(qiáng)子-miRNA FFL的識別

1.2.1 增強(qiáng)子-miRNA調(diào)控關(guān)系的識別 從GENCODE［9］數(shù)據(jù)庫得到蛋白編碼基因的注釋信息，提取得到蛋白編碼基因的轉(zhuǎn)錄起始位點信息。從FANTOM5［10］數(shù)據(jù)庫獲取miRNA的轉(zhuǎn)錄起始位點信息。根據(jù)Suzuki等［5］的識別方法，對每個增強(qiáng)子分別找到其距離最近的miRNA轉(zhuǎn)錄起始位點及同方向（同在增強(qiáng)子上游或下游）的蛋白編碼基因的轉(zhuǎn)錄起始位點。將增強(qiáng)子中心與最近的miRNA轉(zhuǎn)錄起始位點的距離記為M，增強(qiáng)子中心與同方向基因轉(zhuǎn)錄起始位點的距離記為G，根據(jù)公式（1）計算Score值，以0.2為閾值，設(shè)定Score得分在0-0.2范圍內(nèi)的增強(qiáng)子與miRNA為可能存在的調(diào)控關(guān)系。

從ENCODE數(shù)據(jù)庫中下載得到HepG2細(xì)胞系中miRNA的表達(dá)量信息，據(jù)此對上述調(diào)控關(guān)系進(jìn)行篩選，只有涉及在HepG2細(xì)胞系中表達(dá)的miRNA的調(diào)控關(guān)系被采用為最后的結(jié)果。

1.2.2 轉(zhuǎn)錄因子-增強(qiáng)子調(diào)控關(guān)系的識別 從UCSC及CistromeDB［11］數(shù)據(jù)庫中下載得到HepG2細(xì)胞系中65個轉(zhuǎn)錄因子的ChIP-seq數(shù)據(jù)，作為轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點的信息。如果轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點落在增強(qiáng)子區(qū)間內(nèi)，則認(rèn)為該轉(zhuǎn)錄因子與該增強(qiáng)子存在調(diào)控關(guān)系。

1.2.3 轉(zhuǎn)錄因子-miRNA調(diào)控關(guān)系的識別 若1.2.2中得到的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點信息落在miRNA轉(zhuǎn)錄起始位點上游10 kb～下游1 kb范圍內(nèi)，則認(rèn)為該轉(zhuǎn)錄因子對于該miRNA存在調(diào)控關(guān)系［12］。

1.2.4 轉(zhuǎn)錄因子-增強(qiáng)子-miRNA FFL的識別 根據(jù)1.2.1 1.2.2 1.2.3中的調(diào)控關(guān)系得到轉(zhuǎn)錄因子-增強(qiáng)子-miRNA FFL。對于所得結(jié)果進(jìn)行超幾何檢驗，如公式（2）所示，M、N和k分別代表miRNA總數(shù)、細(xì)胞中所有受到轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控的miRNA數(shù)量、細(xì)胞中受某一轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控的miRNA數(shù)量，所得p值越小，說明對應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子和增強(qiáng)子共同調(diào)控的miRNA數(shù)量越多。隨后，通過Benjamini-Hochberge［13］方法，根據(jù)p值得到FDR值，設(shè)定q值在0-0.05范圍內(nèi)的為非隨機(jī)出現(xiàn)的FFL，即所得最終結(jié)果。

1.3 對于FFL中涉及的重要miRNA的功能分析

1.3.1 核心miRNA的篩選 根據(jù)所得的FFL統(tǒng)計涉及的每個miRNA參與的FFL數(shù)目，得到其中參與FFL數(shù)目明顯高于總體平均值的miRNA（參與FFL數(shù)大于上界，在所有miRNA的參與FFL數(shù)中屬于上離群點范圍），定義為FFL中的核心miRNA。

1.3.2 靶基因預(yù)測 從 TarBase［14］，mirTarBase［15］數(shù)據(jù)庫下載得到實驗驗證的miRNA的靶基因信息。分別得到2.3.1中核心miRNA的靶基因。

1.3.3 功能富集分析 利用R軟件包clusterProfiler［16］，對于上述得到的所有靶基因做Gene Ontology（GO）［17］、KEGG Pathway［18］富集分析。

2 結(jié)果

2.1 增強(qiáng)子識別

根據(jù)DNase高敏位點及組蛋白修飾，最終得到5 055個增強(qiáng)子。這些增強(qiáng)子的DNase及3類組蛋白修飾信號分布趨勢，如圖1所示。

從圖1可知增強(qiáng)子中心上下游1 kb存在顯著的DNase活性。另外，在增強(qiáng)子區(qū)域存在高的H3K27ac信號，以及高的H3K4me1信號與低的H3K4me3信號。

2.2 轉(zhuǎn)錄因子-增強(qiáng)子-miRNA FFL

通過超幾何檢驗，過濾q值小于0.05的結(jié)果后，我們最終得到2 070個FFL，因增強(qiáng)子調(diào)控miRNA以正調(diào)控為主，因為本文識別的增強(qiáng)子為連貫FFL。這些FFL共涉及57個轉(zhuǎn)錄因子，180個增強(qiáng)子，85個miRNA。

圖1 DNase及組蛋白修飾信號

圖2 參與FFL的核心miRNA靶基因的基因功能注釋結(jié)果

2.3 功能富集分析結(jié)果

利用R軟件包clusterProfiler［16］，我們對識別的2 070個FFL的miRNA涉及的靶基因進(jìn)行了GO［17］與KEGG［18］功能富集分析，結(jié)果（圖2）表明FFL中miRNA的靶基因顯著富集于肝癌相關(guān)的信號通路或生物進(jìn)程。如病毒致癌通路、p53信號通路、細(xì)胞周期相關(guān)的通路、細(xì)胞周期阻滯等。

2.4 hsa-miR-574功能

在2 070個FFL涉及的85個miRNA中，有5個miRNA在腫瘤和正常樣本中存在表達(dá)差異（|log2（FC）|＞1，p＜=0.05），分別為 hsa-miR-455（|log2（FC）|：2.803），hsa-miR-224（|log2（FC）|：3.615），hsamiR-452（|log2（FC）|：3.111），hsa-miR-10b（|log2（FC）|：2.989），hsa-miR-574（|log2（FC）|：2.799）。此外，從絕對表達(dá)量來講，上述5個miRNA中hsamiR-574和hsa-miR-92a的表達(dá)量（CPM）顯著高于85個總miRNA的表達(dá)量平均值（85個miRNA在肝癌細(xì)胞中CPM平均值7.48，hsa-miR-574的CPM為129.96，hsa-miR-92a的 CPM 為 98.81）。

圖3 涉及hsa-miR-574的FFL構(gòu)成的網(wǎng)絡(luò)圖

結(jié)果顯示hsa-miR-574在HepG2中顯著參與了多的FFL（平均每個miRNA參與24個FFL，hsamiR-574參與的FFL數(shù)量為99個，圖3），這在hsamiR-574參與的99個FFL中共涉及4個增強(qiáng)子（chr4：38160530-38164680，chr4：38162070-38166220，chr4：38179330-38184380，chr4：38223510-38227660）和29個轉(zhuǎn)錄因子。在這些轉(zhuǎn)錄因子中，有 16個 參與了 4個 FFL（NFIC，MAX，HNF4G，RAD21，ARID3A，TAF1，CREB1，HDAC2，MYBL2，F(xiàn)OXA2，HNF4A，RXRA，F(xiàn)OXA1，JUND，F(xiàn)OSL2，SP1），為參與FFL的數(shù)目最多。而在4個增強(qiáng)子中，chr4：38162070-38166220參與的調(diào)控FFL數(shù)量最多，為29個。

為此，我們對這一個miRNA的靶基因進(jìn)行了KEGG通路富集分析，結(jié)果（圖4）顯示hsamiR-574的靶基因顯著與多個腫瘤相關(guān)的信號通路有關(guān)。其中，富集最為顯著的通路——cAMP信號通路被已有文獻(xiàn)證明可以抑制肝癌細(xì)胞增殖而促進(jìn)其分化［19］。

圖4 hsa-miR-574靶基因的KEGG通路富集結(jié)果

3 討論

根據(jù)我們識別的5 055個增強(qiáng)子的組蛋白修飾信號分布來看，DNase信號顯著富集在增強(qiáng)子中心附近，這與活性增強(qiáng)子的染色體開放特征一致。另外，這些增強(qiáng)子體現(xiàn)出高的H3K27ac信號以及高的H3K4me1/H3K4me3占比，這與先前文獻(xiàn)報道的活性增強(qiáng)子信號特征一致。最終我們識別了2 070個FFL，其中65個轉(zhuǎn)錄因子有57個參與了FFL（占88%），而相比轉(zhuǎn)錄因子而言，增強(qiáng)子和miRNA參與的FFL比例要明顯低于轉(zhuǎn)錄因子，這一結(jié)果說明在FFL中，轉(zhuǎn)錄因子起到廣泛結(jié)合的作用，而增強(qiáng)子與miRNA由于其特異性導(dǎo)致參與的FFL相對較少。在功能富集方面，結(jié)果表明FFL中miRNA的靶基因顯著富集于肝癌相關(guān)的信號通路或生物進(jìn)程中，這些結(jié)果說明我們基于肝癌組學(xué)數(shù)據(jù)識別的FFL顯著與腫瘤相關(guān)，這也驗證了我們識別的FFL的有效性。此外，除了從表達(dá)正常與腫瘤組織的表達(dá)差異與絕對表達(dá)量多少來衡量miRNA參與腫瘤的重要性外，對于處于FFL網(wǎng)絡(luò)中的miRNA來說，miRNA參與FFL的頻率是考量miRNA在腫瘤網(wǎng)絡(luò)中是否起關(guān)鍵作用的另一重要因素。因此，我們重點考察了hsa-miR-574在網(wǎng)絡(luò)中的出現(xiàn)頻率，結(jié)果顯示hsamiR-574參與的99個FFL，較平均的24個FFL顯著高，并且功能富集分析也發(fā)現(xiàn)hsa-miR-574的靶基因顯著與多個腫瘤相關(guān)的信號通路有關(guān)。之前已有文獻(xiàn)表明，肝癌患者體細(xì)胞中hsa-miR-574的表達(dá)量顯著高于正常樣本，由此推測該miRNA可以作為肝癌診斷的腫瘤標(biāo)記物，這與我們的結(jié)果相符合［20］。研究結(jié)果初步探討了以增強(qiáng)子-miRNA為核心的FFL在肝細(xì)胞癌中的特征與功能，有望為基于網(wǎng)絡(luò)模體為單位的肝腫瘤標(biāo)志物識別奠定理論與數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本文基于肝癌細(xì)胞系HepG2中的DNase高敏位點以及H3K4me1、H3K27ac、H3K4me3組蛋白修飾特征這些普遍認(rèn)可的表觀遺傳學(xué)特征為識別活性增強(qiáng)子的理論基礎(chǔ)，識別共得到5 055個肝癌特異的增強(qiáng)子。通過處理增強(qiáng)子與miRNA位置信息，以及65個轉(zhuǎn)錄因子的ChIP-seq數(shù)據(jù)獲得轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點，構(gòu)建了增強(qiáng)子-miRNA、轉(zhuǎn)錄因子-miRNA與轉(zhuǎn)錄因子-miRNA調(diào)控關(guān)系。通過超幾何檢驗篩選了2 070個FFL。其中共涉及57個轉(zhuǎn)錄因子，180個增強(qiáng)子與85個miRNA。GO與KEGG功能富集分析FFL的miRNA靶基因顯示這些靶基因廣泛的參與了與肝癌的發(fā)生發(fā)展相關(guān)的生物學(xué)進(jìn)程與調(diào)控通路。