張海波， 謝偉娜， 唐國華， 陳 跡, 胡君萍， 楊建華,

(新疆醫(yī)科大學(xué)1第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部， 烏魯木齊 830054； 2藥學(xué)院， 烏魯木齊 830011)

肺炎合劑是新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院在治療小兒肺炎經(jīng)驗方的基礎(chǔ)上研制開發(fā)的院內(nèi)制劑，由麻黃、杏仁、石膏、甘草等8味中藥制成，具有清肺平喘、消炎止咳、辛涼解表的功效[1]，臨床上主要用于小兒急性肺炎及急性支氣管炎等病癥的治療。方中麻黃為君藥，性辛溫，具有解表散邪、宣肺平喘的功效，主要活性成分為鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿，具有鎮(zhèn)咳、祛痰、平喘、抗炎、興奮中樞等作用[2-3]?，F(xiàn)行質(zhì)量標準僅對肺炎合劑相對密度、 pH等指標進行了檢查[4]，定性鑒別及定量控制指標缺失，不能實現(xiàn)對該制劑全面有效的質(zhì)控。本研究采用薄層色相(TLC)法對君藥麻黃中鹽酸麻黃堿進行了鑒別，采用高效液相色譜(HPLC)法對方中君藥麻黃中主要活性成分鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿進行了含量測定，現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器BP211D型分析天平(德國Sartorius公司)，DGU-20A5R型高效液相色譜儀(日本島津公司)，SPD-M20A型檢測器(日本島津公司)，LabSolution液相工作站(日本島津公司)，F(xiàn)JY1002-4VF基因研究型超純水機(青島富勒姆科技有限公司)，LG10-2.4A型高速冷凍離心機(中科中佳科學(xué)儀器有限公司)，MS 3 basic型渦旋振蕩器(德國IKA公司)，DZKW型4孔電子恒溫水浴鍋(北京永興明醫(yī)療儀器廠)，KQ-200VDB型超聲波清洗機(昆山市超聲儀器有限公司)，F(xiàn)E20型pH計(瑞士Mettler-Toledo公司)。

1.2 試藥鹽酸麻黃堿(中國藥品生物制品檢定所，批號：0090-9801)，鹽酸偽麻黃堿(國家麻醉品實驗室，批號：1237-9601)；甲醇(美國Fisher公司，批號：184267)，濃氨水(烏魯木齊西北化學(xué)品廠，批號：000713)，磷酸(天津市北聯(lián)精細化學(xué)品開發(fā)有限公司，批號：141020)，肺炎合劑(新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院自制，批號：180521、180524、180530)，肺炎合劑陰性樣品(按處方制備缺麻黃樣品，實驗室自制)，試驗用水為去離子水。

2 方法與結(jié)果

2.1 麻黃的薄層鑒別取肺炎合劑20 mL，用濃氨水調(diào)pH至11，加入三氯甲烷30 mL，加熱回流1 h，放至室溫，轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，用三氯甲烷反復(fù)萃取，將萃取液轉(zhuǎn)入分液漏斗中，取三氯甲烷層，蒸干，殘渣用甲醇 2 mL 溶解，充分振蕩，濾過，即得供試品溶液。取肺炎合劑陰性樣品，按上述方法制備即得陰性供試品溶液。稱取鹽酸麻黃堿對照品適量，用甲醇溶解制得濃度為1.10 mg/mL對照品溶液。分別吸取肺炎合劑陰性供試品溶液、鹽酸麻黃堿對照品溶液、肺炎合劑供試品溶液各 5 μL，點于同一硅膠G 薄層板上，以氯仿-甲醇-濃氨試液 (20∶5∶0.5) 為展開劑展開，取出晾干，噴以 2% 茚三酮乙醇溶液，105℃加熱至斑點清晰，可見光下檢。樣品色譜中在與鹽酸麻黃堿對照品相應(yīng)的位置上(Rf=0.51)顯示相同顏色的的斑點，斑點清晰，肺炎合劑陰性樣品在相應(yīng)的位置上無斑點。

2.2 鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿的含量測定

2.2.1 色譜條件 采用 Shim-pack GIST C18-HP 色譜柱(150 mm×2.1 mm, 3 μm，日本島津公司)，以甲醇(A)和0.1% 磷酸溶液(B，含0.1%三乙胺)為流動相，梯度洗脫(0～10 min，5% A；10～15 min，5%→90% A；15～20 min，90% A；20～25 min，90%→5% A；25～30 min，5% A)，檢測波長 210 nm，流速 0.3 mL/min，柱溫 35℃，進樣量 5 μL。在此條件下，肺炎合劑中鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿與其他成分分離效果良好，理論板數(shù)均>4 000。

2.2.2 混合對照品溶液的制備 分別稱取鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿對照品10 mg，置10 mL 量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，即得對照品儲備液，分別吸取對照品儲備液適量，置10 mL 量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻，得到鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿質(zhì)量濃度分別為552、558 μg/mL的混合對照品儲備液。將該混合對照品儲備液進行逐級稀釋，即得不同濃度混合對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 取肺炎合劑10 mL置于具塞錐形瓶中，用濃氨水調(diào)pH為11，加入20 mL 三氯甲烷超聲(100 W，35 kHz)提取3次，每次30 min，合并三氯甲烷提取液，蒸干，殘渣用甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至5 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，經(jīng)微孔濾膜(0.22 μm)濾過，即得供試品溶液。

2.2.4 陰性供試品溶液的制備 取肺炎合劑陰性樣品，按 “2.2.3” 項下方法制備，即得陰性供試品溶液。

2.2.5 陰性干擾試驗 按“2.2.1”項下色譜條件分別測定鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿混合對照品溶液、供試品溶液及陰性供試品溶液，結(jié)果陰性供試品溶液與鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿混合對照品溶液色譜峰無干擾，見圖1-3。

圖1 鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿混合對照品HPLC色譜圖

2.2.6 回歸方程的建立 分別吸取 “2.2.2” 項下不同濃度混合對照品溶液 5 μL，按 “2.2.1” 項下色譜條件測定，以進樣濃度(X)為橫坐標，峰面積(Y)為縱坐標，繪制標準曲線，鹽酸麻黃堿的回歸方程為：Y=21 521X-408 921，r=0.999 4，鹽酸偽麻黃堿的回歸方程為：Y=21 911X-420 875，r=0.999 8，鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿進樣濃度分別在 8.62～138.00、8.72～140.00 μg/mL 的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.7 精密度試驗 取同一份供試品溶液，連續(xù)進樣6次，測定鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿峰面積， RSD分別為4.9%、2.4%，表明儀器精密度良好。

圖2 肺炎合劑HPLC色譜圖

2.2.8 穩(wěn)定性試驗 取同一份供試品溶液，分別在 0、4、8、16、24 h 進樣分析，測定鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿峰面積， RSD分別為6.3%、2.6%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

圖3 陰性供試品HPLC色譜圖

2.2.9 重復(fù)性試驗 取同一批肺炎合劑5份，按“2.2.3”項下方法，制備成供試品溶液，進樣測定鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿峰面積，RSD分別為6.5%、7.0%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.10 加樣回收率試驗 量取已測得含量的肺炎合劑5 mL共9份，分別加入鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿對照品溶液適量，每3份加入相同量，按“2.2.3”項下方法制備供試溶液，按“2.2.1”項下色譜條件下進行測定，計算加樣回收率，表明該方法回收率良好，見表1。

表1 加樣回收率試驗結(jié)果(n=3)

2.2.11 樣品含量測定 取肺炎合劑，按“2.2.3”項下方法制備肺炎合劑供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件下進行測定，用外標法計算3批肺炎合劑中鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿的含量，見表2。

表2 肺炎合劑中鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿的含量(μg/mL， n=3)

3 討論

肺炎合劑中君藥麻黃的主要活性成分是鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿，為苯丙胺類生物堿，多數(shù)以鹽的形式存在于植物中，當(dāng)其處于游離狀態(tài)時具有良好的脂溶性，采用親脂性有機溶劑提取時，必須先用石灰乳、碳酸鈉溶液或稀氨水等堿水將生物堿由鹽的形式堿化為游離型生物堿，再用氯仿、二氯甲烷或苯等親脂性有機溶劑萃取[5]。本研究在參考文獻[6]的基礎(chǔ)上，在樣品前處理過程中，在肺炎合劑中先加入濃氨水調(diào)pH至11充分堿化，加入三氯甲烷萃取，鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿提取效果較好。

鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿是一對差向異構(gòu)體，而薄層色譜分離能力有限，無法實現(xiàn)對2種化合物的有效分離，因此在薄層鑒別中僅對鹽酸麻黃堿進行了考察；《中國藥典》2015年版(一部)麻黃含量測定采用了專用色譜柱-極性乙醚聯(lián)合苯基鍵和硅膠柱[7]，該色譜柱并不普遍且價格較高，在實際工作中獲取和使用受到限制。本研究采用C18色譜柱建立肺炎合劑中鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿含量測定方法，考察了不同有機相、不同流速、不同緩沖液體系[8-14]、不同比例等，分離效果均欠佳。經(jīng)反復(fù)優(yōu)化，最終確定的流動相體系為甲醇-0.1%磷酸溶液(含0.1%三乙胺)(梯度)，鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿峰型較佳、分離度較好、雜質(zhì)不干擾測定。本研究采用TLC法對君藥麻黃中鹽酸麻黃堿進行了鑒別，選用HPLC對君藥麻黃中主要活性成分鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿進行了含量測定，初步建立了肺炎合劑的定性定量的方法，對制劑工藝的穩(wěn)定性以及質(zhì)量控制提供了理論依據(jù)。