王志超，馮凡超，武 琦，顧 誠，徐 泳，周賢梅

(南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇省中醫(yī)院呼吸科，南京 210029)

特發(fā)性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)是特發(fā)性間質(zhì)性肺炎的最常見形式，是一種慢性的、進(jìn)行性的、不可逆性的和致命性的肺部疾病，主要發(fā)生在中老年人(診斷中位年齡為66歲，范圍為55～75歲)，局限于肺部，具有典型間質(zhì)性肺炎的病理學(xué)或放射學(xué)改變[1]。但目前IPF患者人數(shù)較少，且很難獲得患者的肺組織樣本，因此建立穩(wěn)定可靠的動(dòng)物模型對(duì)于研究IPF及其他肺纖維化疾病具有重要意義。

目前常用的肺纖維化模型主要是嚙齒類動(dòng)物，主要包括小鼠、大鼠、倉鼠和兔等[2-5]，主要用于誘導(dǎo)肺纖維化的誘導(dǎo)劑包括博萊霉素(bleomycin，BLM)、胺碘酮、石棉、二氧化硅、呼吸道腸道病毒等，其中使用最廣泛的是BLM[6]。BLM是輪生鏈霉菌中提取的一種抗腫瘤藥物，肺纖維化是其主要毒副作用之一，用BLM制作的肺纖維化模型，其組織病理學(xué)和生理學(xué)改變與人類肺纖維化相似，因此成為肺纖維化的經(jīng)典模型[7]。且最新研究表明，BLM多次給藥比單次給藥形成的肺纖維化模型更接近臨床IPF患者，但目前應(yīng)用仍較少[8]。常用的造模方式有經(jīng)氣管給藥、氣管灌注、霧化吸入、經(jīng)鼻給藥、腹腔注射、尾靜脈注射等[9]，又以經(jīng)氣管給藥的運(yùn)用最為廣泛[10]。

我們?cè)陂L期的IPF研究中，常常運(yùn)用BLM氣管內(nèi)給藥建立小鼠肺纖維化模型，造模的方法從最經(jīng)典的氣管切開造模法逐漸改良為腰穿針氣管插管造模法和留置針氣管插管造模法，但從未比較過這三種方法的優(yōu)缺點(diǎn)。本次實(shí)驗(yàn)同時(shí)運(yùn)用三種方法進(jìn)行造模，以期提供一種最穩(wěn)定可靠的BLM氣管內(nèi)給藥的造模方法，供實(shí)驗(yàn)研究。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雄性C57BL/6J小鼠，25～27 g，10周齡，購于北京唯尚立拓科技有限公司[SCXK(京)2016-0009]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均在南京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[SYXK(蘇)2018-0049]完成。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)由實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理委員會(huì)批準(zhǔn)(倫理審批號(hào)：201810A031)，所有操作均符合動(dòng)物倫理學(xué)要求，并按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則給予人道的關(guān)懷。

1.2 主要試劑與儀器

注射用鹽酸博萊霉素(BLM，海正輝瑞)，多聚甲醛(Macklin)，磷酸緩沖鹽溶液(PBS，Gibco)，羥脯氨酸ELISA試劑盒(上海西唐)，75%酒精，液氮，一次性1 mL注射器，濾紙，棉球。7號(hào)腰穿針，一次性留置針(見圖1)，眼科剪，眼科鑷，手術(shù)刀柄，手術(shù)刀片，縫合針，縫合線，小型手電筒，移液器，多功能酶標(biāo)儀(Infinite 200 pro，Tecan)。

圖1 腰穿針和留置針Figure 1 Lumbar spinal needle and indwelling needle

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

將120只C57BL/6 J小鼠隨機(jī)分為4組，分別為空白組、腰穿針氣管插管模型組、留置針氣管插管模型組和氣管切開模型組，每組30只；每組又隨機(jī)分為3組，分別為14 d組，21 d組和28 d組，每組10只；空白組常規(guī)飼養(yǎng)，腰穿針氣管插管模型組利用腰穿針氣管插管造模法氣管插管注射BLM，留置針氣管插管模型組利用留置針氣管插管造模法氣管插管注射BLM，氣管切開模型組利用氣管切開造模法注射BLM。觀察小鼠的一般情況(體重變化和存活率)，并分別于造模后14 d、21 d、28 d處死小鼠，每次5～6只，取左右肺各一葉置于多聚甲醛中固定，其余肺組織置于液氮中速凍，-80℃保存；觀察組織病理學(xué)改變(HE染色和Masson染色)，并檢測(cè)羥脯氨酸水平。

表1 肺組織肺泡炎及肺纖維化程度判定標(biāo)準(zhǔn)

1.3.1 腰穿針/留置針氣管插管造模法

小鼠麻醉后將其固定，腹部朝上，頭部稍抬高與水平面約成15°角，用眼科鑷將小鼠舌尖夾住向外向上拉出，并用小型手電筒垂直照射小鼠頸部，通過小鼠口腔觀察小鼠咽喉部，可以在紅色光亮處觀察到聲門開合；a)將磨鈍的腰穿針針頭緊貼舌根中央，向光亮處緩緩進(jìn)針，進(jìn)針深度約2.8 cm，若進(jìn)針有明顯阻力，應(yīng)調(diào)整位置和角度重新進(jìn)針，切勿強(qiáng)行進(jìn)針導(dǎo)致氣道損傷或穿孔；b)將留置針穿刺針尖頭退至軟導(dǎo)管中，確保針頭柔軟而針體堅(jiān)硬，將留置針緊貼舌根中央，向光亮處緩緩進(jìn)針，留置針長約2.1 cm，可全部插入氣管，若進(jìn)針有明顯阻力，應(yīng)調(diào)整位置和角度重新進(jìn)針，切勿強(qiáng)行進(jìn)針；向腰穿針/留置針中注入BLM(5 U/kg)，并注入1 mL空氣以助BLM在肺部分散；將小鼠直立左右前后輕輕搖晃，以助BLM在肺部均勻分布，避免液體堵塞氣道致小鼠窒息死亡(見圖2)。

圖2 留置針氣管插管造模法操作示意圖Figure 2 Schematic diagrams of tracheal intubation by an indwelling needle

1.3.2 氣管切開造模法

麻醉并固定小鼠(方法同1.3.1)，修剪頸部鼠毛，乙醇消毒，切開頸部皮膚和肌肉，切口長約5 mm，并延甲狀腺中央輕輕切開，分離甲狀腺，鈍性分離氣管周圍組織粘膜，暴露氣管；用留置針從甲狀軟骨刺入氣管中，抽出穿刺針，注入BLM(5 U/kg)，將小鼠直立左右前后輕輕搖晃，以助BLM在肺部均勻分布，避免液體堵塞氣道致小鼠窒息死亡，縫合肌肉皮膚，酒精消毒手術(shù)切口及周圍皮膚。

1.3.3 肺組織肺泡炎及肺纖維化程度判定標(biāo)準(zhǔn)

按Szapiel等[11]的方法評(píng)價(jià)肺組織病理變化嚴(yán)重程度(見表1)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 一般情況

2.1.1 體重變化

除空白組，三組模型組小鼠在造模后第0～6天，體重均有明顯下降，其中氣管切開模型組體重下降最明顯；造模后大約在第10～12天，三組模型組小鼠再次出現(xiàn)體重下降，持續(xù)約2～4 d；造模后大約在第20～22天，三組模型組小鼠第三次出現(xiàn)體重下降，持續(xù)約2～4 d；其余時(shí)間各組小鼠體重均緩慢增長；通過獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)除空白組和留置針氣管插管模型組間外，其余各組間小鼠第28天體重均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(見圖3)。

注：B：空白組；L：腰穿針氣管插管模型組；I：留置針氣管插管模型組；T：氣管切開模型組。ns：差異無顯著性；*P< 0.05，**P< 0.01，***P< 0.001。圖3 四組小鼠造模后體重變化曲線Note. B, Blank group. L, Lumbar spinal needle group. I, Indwelling needle group. T, Tracheotomy group. ns: non-significance;*P< 0.05,**P< 0.01,***P< 0.001.Figure 3 Weight change curve of the four groups of mice after modeling

2.1.2 存活率

留置針氣管插管模型組小鼠存活率最高，為90%；腰穿針氣管插管模型組小鼠存活率其次，為80%；氣管切開模型組小鼠存活率最低，僅為60%；Fisher精確檢驗(yàn)顯示，空白組與腰穿針氣管插管模型組、留置針氣管插管模型組比較，無顯著性差異(P=0.237、P=0.500)，與氣管切開模型組分別比較，有顯著性差異(P=0.043)；腰穿針氣管插管模型組與留置針氣管插管模型組比較，無顯著性差異(P>0.999)；氣管切開模型組與腰穿針氣管插管模型組比較，無顯著性差異(P=0.628)；氣管切開模型組與留置針氣管插管模型組比較，無顯著性差異(P=0.303)(見圖4)。

2.2 組織病理學(xué)

通過HE染色和Masson染色我們可以發(fā)現(xiàn)，空白組：肺泡形態(tài)正常，肺泡壁纖細(xì)，肺間質(zhì)無炎癥細(xì)胞浸潤；腰穿針氣管插管模型組：肺泡炎及肺纖維化程度++～+++，肺組織中有較多的片狀實(shí)變區(qū)，實(shí)變區(qū)間見肺泡壁增厚，間隔增寬，有較多的炎癥細(xì)胞浸潤和膠原沉積，第21天最明顯，左右肺分布欠均勻；留置針氣管插管模型組：肺泡炎及肺纖維化程度+～++，小片肺組織實(shí)變，其中有炎癥細(xì)胞浸潤和少量膠原沉積，第21天較明顯，左右肺分布欠均勻；氣管切開模型組：肺泡炎及肺纖維化程度++～+++，可見大片的肺實(shí)變，大量炎細(xì)胞浸潤會(huì)和膠原沉積，第21天最明顯，左右肺分布較均勻(見表2、圖5、6)。

2.3 羥脯氨酸

通過羥脯氨酸ELISA試劑盒檢測(cè)肺組織羥脯氨酸水平以及獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)在第21天，三組模型組羥脯氨酸含量顯著高于空白組(P<0.001、P<0.05、P<0.001)，在第28天，腰穿針氣管插管模型組和氣管切開模型組羥脯氨酸含量顯著高于空白組(P<0.01、P<0.001)，而留置針氣管插管模型組與空白組相比無顯著性差異(見圖7)。

3 討論

BLM臨床用于治療多種腫瘤疾病，主要的不良反應(yīng)是誘發(fā)嚴(yán)重的肺纖維化[7]，其誘導(dǎo)的肺纖維化模型與人類肺纖維化相似，廣泛運(yùn)用于肺纖維化的基礎(chǔ)研究。1974年，Adamson等[12]首次采用多次腹腔注射BLM的方法建立了鼠肺纖維化模型，此后發(fā)現(xiàn)對(duì)多種動(dòng)物采用多種方式使用BLM均可建立肺纖維化模型，并探索了BLM的最佳造模劑量[7, 13]。雖然BLM誘導(dǎo)的肺纖維化模型有助于理解和研究肺纖維化的發(fā)病機(jī)制，但在研究IPF時(shí)有其局限性，比如對(duì)于IPF疾病起源的上皮細(xì)胞影響較小，造模21 d后肺纖維化逐漸緩解等。有研究表明BLM多次給藥比單次給藥誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化模型更接近IPF患者，造模方式更接近IPF肺泡持續(xù)微損傷和修復(fù)的發(fā)病機(jī)制[8]。但由于成模時(shí)間長，小鼠存活率低，僅少數(shù)研究采用這種造模方式[14-16]，多數(shù)研究仍采用單次給藥的經(jīng)典模型[17-19]。

注：B：空白組；L：腰穿針氣管插管模型組；I：留置針氣管插管模型組；T：氣管切開模型組。圖4 四組小鼠造模后存活率Note. B, Blank group. L, Lumbar spinal needle group. I, Indwelling needle group. T, Tracheotomy group.Figure 4 Survival rate of the four groups of mice after modeling

表2 肺組織肺泡炎及肺纖維化程度

注：L：左肺；R：右肺。圖6同。圖5 造模后14 d、21 d和28 d肺組織HE染色(× 100)Note. L, Left lung; R, Right lung. The same in the figure 6.Figure 5 Lung tissue at 14, 21 and 28 days after modeling. HE staining

圖6 造模后21 d肺組織的病理改變(Masson染色，× 200)Figure 6 Histology of the lung tissues at 21 days after modeling. Masson staining

注：B：空白組(n=6)；L：腰穿針氣管插管模型組(n=6)；I：留置針氣管插管模型組(n=6)；T：氣管切開模型組(n=5)。ns：差異無顯著性；*P< 0.05，**P< 0.01，***P< 0.001。圖7 肺組織羥脯氨酸水平Note. B, Blank group (n=6). L, Lumbar spinal needle group (n=6). I, Indwelling needle group (n=6). T, Tracheotomy group (n=5).ns: non-significance;*P< 0.05,**P< 0.01,***P< 0.001.Figure 7 Levels of hydroxyproline in the lung tissues

目前，國內(nèi)外較為公認(rèn)的方法是經(jīng)氣管給藥，但對(duì)操作者技術(shù)要求較高，其他給藥方法主要有氣管灌注、霧化吸入[20]、經(jīng)鼻給藥[21]、腹腔注射[22]和尾靜脈注射[23-24]。氣管灌注具有動(dòng)物存活率高、成模時(shí)間短、成功率高等優(yōu)點(diǎn)，但對(duì)技術(shù)要求較高；霧化吸入可使藥物在體內(nèi)均勻分布，但需要特殊裝置，且吸入劑量不可控，使用較少；經(jīng)鼻給藥所需麻醉時(shí)間短，操作快捷，對(duì)動(dòng)物損傷小，但對(duì)技術(shù)熟練度要求非常高；腹腔注射可以避免因操作差異性造成的纖維化程度差異性，且操作簡單，動(dòng)物存活率高，病灶分布較均勻，但給藥次數(shù)較多、劑量較大、成模時(shí)間較長，成本較高，因此具有一定限制性；尾靜脈注射主要應(yīng)用于小鼠模型，其成模時(shí)間短，但操作難度較大，成功率不高[10]。

本課題組在IPF的基礎(chǔ)研究中嘗試過多種方法制作BLM小鼠肺纖維化模型，最常用的是經(jīng)氣管給藥法和氣管灌注法。本實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)比較了經(jīng)氣管給藥法(氣管切開造模法)和兩種氣管灌注法(腰穿針氣管插管造模法和留置針氣管插管造模法)。除了病理組織學(xué)檢測(cè)，我們還檢測(cè)了肺組織羥脯氨酸水平，羥脯氨酸在膠原組織中占13.4%，在彈性蛋白中含量極低，而在其他蛋白中均不存在，因此羥脯氨酸水平常用來反映膠原沉積水平，也是反映肺纖維化程度的一個(gè)較為客觀的指標(biāo)[25]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見，氣管切開造模法獲得的小鼠肺纖維化模型肺泡炎和肺纖維化程度最高，病灶分布最均勻；腰穿針氣管插管造模法獲得的小鼠肺纖維化模型肺泡炎和肺纖維化程度較高，病灶分布不及氣管切開造模法均勻，以氣管周圍為主；留置針氣管插管造模法獲得的小鼠肺纖維化模型肺泡炎和肺纖維化程度最低，病灶分布不均勻，以氣管周圍為主；各組小鼠存活率存在差異，除空白組外，氣管切開模型組最低，留置針氣管插管模型組最高，空白組和氣管切開模型間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，其余各組間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。綜合各種因素，腰穿針氣管插管造模法是三種造模方法中最穩(wěn)定可靠的造模方法。

我們還通過實(shí)驗(yàn)結(jié)果得到以下觀點(diǎn)：①模型組小鼠體重三次下降的原因可能分別是造模操作后損傷、肺泡炎基本形成和肺纖維化基本形成，因此造模后第22～24天可能是肺纖維化最嚴(yán)重的時(shí)期，之后會(huì)逐漸緩解；②腰穿針氣管插管造模法和留置針氣管插管造模法小鼠存活率均較高，但對(duì)于不熟練的操作者，存活率約為70%；又由于留置針針體柔軟且長度較短，對(duì)小鼠的損傷低于腰穿針，故留置針氣管插管造模法小鼠存活率略高于腰穿針氣管插管造模法；③腰穿針氣管插管造模法與留置針氣管插管造模法原理和操作基本相同，但腰穿針氣管插管造模法優(yōu)勢(shì)明顯，可能是由于腰穿針針體堅(jiān)硬且長度較長，有利于BLM在氣管深處的灌注及在肺部的分散，而留置針針體柔軟且長度較短，可能會(huì)被小鼠咽喉壓迫而堵塞，導(dǎo)致BLM不能充分注入氣管和肺部；④造模后小鼠死亡主要集中在第5～8天和第13～16天兩個(gè)階段，第16天后沒有再出現(xiàn)小鼠死亡，第一階段可能主要由造模的操作損傷所致，第二階段可能主要由重度的肺泡炎所致；⑤部分空白組小鼠也表現(xiàn)出輕微的肺纖維化，可能是由于動(dòng)物飼養(yǎng)中使用的墊料存在粉塵，粉塵吸入亦是造成肺纖維化的原因之一，因此在動(dòng)物飼養(yǎng)中應(yīng)避免使用木屑和刨花，應(yīng)使用粉塵較少的玉米棒芯。

在長期實(shí)驗(yàn)過程中，我們還總結(jié)了以下經(jīng)驗(yàn)：①腰穿針氣管插管造模法中，腰穿針進(jìn)針深度(針頭至小鼠牙齒的距離)過短易引起藥液回流，過長易戳穿氣管，根據(jù)經(jīng)驗(yàn)，約2.8 cm最為合適；②留置針氣管插管造模法中，由于留置針不具有通氣作用，氣管插管后操作應(yīng)迅速，避免窒息風(fēng)險(xiǎn)；③氣管切開造模法中，切口不宜過長，縫合打結(jié)應(yīng)不留線頭，避免小鼠撕咬導(dǎo)致縫合線斷裂，造模后一周內(nèi)小鼠難以抬頭進(jìn)食，應(yīng)在籠中添加飼料；④注射BLM時(shí)，應(yīng)當(dāng)嚴(yán)格按照小鼠體重抽取準(zhǔn)確劑量的BLM，藥液偏少易致小鼠肺纖維化程度偏低，偏多易致小鼠死亡，最大注射體積不得超過65 μL(26 g小鼠標(biāo)準(zhǔn)劑量)，應(yīng)用藥液潤洗插管器械、注射器等減少誤差。

綜上，腰穿針氣管插管造模法、留置針氣管插管造模法和氣管切開造模法各有利弊，綜合各種因素，腰穿針氣管插管造模法是最理想的造模方法。