趙晶晶

(山西省飼料獸藥監(jiān)察所,太原 030027)

馬波沙星是隸屬于喹諾酮類抗菌藥，目前已在英國、法國、美國和歐洲上市并被列為動物專用藥，馬波沙星對多數(shù)腸桿菌、多殺性巴斯德氏菌、綠膿桿菌、金黃葡萄球菌、中間葡萄球菌的抑制和殺滅作用與恩諾沙星和環(huán)丙沙星相當，對紅霉素、林可霉素、氯霉素、強力霉素、磺胺藥的耐藥病原菌依然有效。馬波沙星組織滲透力強，在體內吸收迅速、完全、分布廣泛，消除半衰期長，安全劑量范圍寬，無明顯生殖和遺傳毒性[1-3]。無論是肌肉注射還是口服給藥，生物利用度都高[4]。目前馬波沙星已能在國內大規(guī)模生產(chǎn)，具有廣闊的應用前景。

藥物雜質影響藥物質量和療效,有必要掌握藥物雜質的產(chǎn)生并采取一定的措施嚴格控制藥品質量。藥物的副作用與雜質有一定的相關關系,掌握微量雜質的形成并避免藥物副作用具有重要意義[5]。研究人員采用高效液相色譜[6-7]及高效液相色譜串聯(lián)質譜[8]的方法分析馬波沙星及其代謝產(chǎn)物,以期對馬波沙星藥物評價提供一定的支持。 馬波沙星化學名為9-氟-2,3-二氫-3-甲基-10-(4-甲基-1-哌嗪基)-7-氧代-7H-吡啶-[3,2,1-ij](4,1,2)苯并惡二嗪-6-羧酸，分子式為C17H19FN4O4，在貯藏過程中會產(chǎn)生雜質，其中以氧化雜質最為明顯，氧化產(chǎn)物為1-氧-4-[9-氟--3-甲基-7-氧代2,3-二氫-7H-吡啶--[3,2,1-ij](4,1,2)苯并惡嗪-10-二甲基氨基]甲基哌嗪-6-羧酸,因而通過對氧化雜質含量的檢測，可以對產(chǎn)品的質量穩(wěn)定性做出判斷。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

1.1.1 儀器 安捷倫1100高效液相色譜儀，二極管陣列檢測器。超聲儀，昆山市超聲儀器有限公司，KQ-250型。水浴鍋，德國JULABO,TW12型。

1.1.2 對照品 馬波沙星對照品，含量為100.0%，批號為PMAB160301B，馬波沙星氧化物對照品含量為99.9%，批號為MABF-YXM-2028-007,二者均來源于海門慧聚藥業(yè)有限公司。

1.1.3 其他試劑 甲醇為色譜純試劑；其他試劑均為分析純試劑。

1.1.4 0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液 取磷酸二氫鉀1.1998 g，置1000 mL量瓶中，加水950 mL使溶解，用磷酸調節(jié)pH值至2.6，用水稀釋至刻度。

1.1.5 辛烷磺酸鈉磷酸鹽緩沖液 取辛烷磺酸鈉2 g，置1000 mL量瓶中，加0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液溶解并稀釋至刻度。

1.1.6 稀釋溶劑[9]取0.01 mol/L的磷酸鹽緩沖液650 mL，加甲醇320 mL,四氫呋喃30 mL,攪拌搖勻，過濾。

1.1.7 硼酸-氯化鉀緩沖液(pH 9.0)[10]取硼酸3.09 g，加0.1 mol/L氯化鉀溶液500 mL使溶解，再加0.1 mol/L氫氧化鈉溶液210 mL，混勻。

1.1.8 馬波沙星片 法國威隆制藥股份有限公司(VETOQUINOL S.A.)生產(chǎn)，規(guī)格80 mg。

1.2 溶液的制備

1.2.1 馬波沙星氧化物對照品儲備液的配制 取馬波沙星氧化物對照品50.05 mg，精密稱定，置500 mL量瓶中，用水使溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為氧化物對照品儲備液。

1.2.2 馬波沙星對照品溶液的配制 取馬波沙星對照80 mg，精密稱定，置200 mL量瓶中，用1.1.6項稀釋溶劑稀釋至刻度，搖勻，超聲處理5 min，置60 ℃水浴振蕩3 min后，再超聲處理10 min，搖勻，作為馬波沙星對照品儲備液。取3.00 mL儲備液置100 mL容量瓶中，用稀釋溶劑稀釋至刻度，作為馬波沙星對照品溶液。

1.2.3 馬波沙星氧化物標準工作液的配制 分別精密量取氧化物對照品儲備液5、3、5、10、5、2、1、1 mL置10、10、25、100、100、100、100、200 mL量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，作為對照品工作液濃度分別為50、30、20、10、5、2、1、0.5 μg/mL。

1.2.4 供試品溶液的配制[9]取馬波沙星片10片，研細，精密稱取適量，約相當于馬波沙星0.1 g，置100 mL量瓶中，用硼酸-氯化鉀緩沖液(pH 9.0)溶解并稀釋至刻度，搖勻，超聲處理5 min，置60 ℃水浴振蕩3 min后，再超聲處理10 min，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液10 mL，置50 mL量瓶中，用稀釋溶劑稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。

1.2.5 光照破壞樣品溶液的配制 取馬波沙星片10片置玻璃平皿中，放在4500 lx的燈下照射1 d，研細，精密稱取適量(約相當于馬波沙星0.1 g)按1.2.4項方法配制，作為光照破壞樣品溶液。

1.2.6 添加樣品溶液的配制 農業(yè)部2329號公告中，馬波沙星氧化物限量為不得過0.5%(W/W)，以此限度作為中間濃度，分別制備3個濃度的樣品。取馬波沙星片30片，研細，精密稱取9份樣品，每份樣品約相當于馬波沙星0.2 g，添加氧化物對照品三個濃度，分別添加 0.8、1、1.2 mg，每個濃度添加三份。完成添加后，置200 mL量瓶中，用硼酸-氯化鉀緩沖液(pH 9.0)溶解并稀釋至刻度，搖勻，超聲處理5 min，置60 ℃水浴振蕩3 min后，再超聲處理10 min，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液10 mL，置50 mL量瓶中，用稀釋溶劑稀釋至刻度，搖勻，作為添加樣品溶液。

1.2.7 馬波沙星與馬波沙星氧化物混合溶液的配制 取1.2.2項馬波沙星對照品儲備液15、20、25 mL分別置50 mL容量瓶中；取1.2.3項中濃度為5 μg/mL的馬波沙星標準工作液10、20、30 mL分別置上述3個容量瓶中，用稀釋溶劑稀釋至刻度，搖勻，作為混合溶液1～3。

1.3 色譜條件 色譜柱：十八烷基硅烷鍵合硅膠，4.6 mm×250 mm，5 μm。柱溫 30 ℃。流動相：辛烷磺酸鈉磷酸鹽緩沖液-甲醇-四氫呋喃(65∶32∶3)。流速1.0 mL/min。檢測波長210～400 nm，分辨率1.2 nm。記錄298 nm波長處的色譜圖。進樣量 10 μL。

2 結果與分析

2.1 準確度 取1.2.6項添加樣品溶液按1.3項色譜條件檢測，結果見表1。

2.2 重復性 取1.2.7項馬波沙星與馬波沙星氧化物混合溶液1～3，按1.3項色譜條件檢測，每份樣品測定3次，計算馬波沙星及馬波沙星氧化物的響應因子，以響應因子作為評價依據(jù)，結果見表2。

表1 準確度測定結果Tab 1 Accuracy test results

表2 重復性測定結果Tab 2 Repeatability test results

續(xù)表

馬波沙星氧化物相對于馬波沙星的相對響應因子為1.03。

2.3 線性 吸取1.2.3項馬波沙星氧化物標準工作液和1.2.1項氧化物對照品儲備液，按照1.3項所述色譜條件測定，標準工作液色譜圖見圖1，測定結果見表3。以峰面積為縱坐標，以馬波沙星氧化物質量濃度C(μg/mL)為橫坐標線性回歸，得回歸方程為：Y=320.74X+56.382 (r2=0.9997)，檢測結果表明，在0.5～100 μg/mL范圍內有良好的線性關系。

表3 線性測定結果Tab 3 Linear measurement results

2.4 專屬性 取1.2.2項馬波沙星對照品溶液及1.2.5項光照破壞樣品溶液，按照1.3項色譜條件測定，檢測結果見圖1～圖6，馬波沙星與馬波沙星氧化物在檢測過程中相互不干擾，馬波沙星在光照條件下不穩(wěn)定，由光照破壞樣品溶液檢測結果來看，馬波沙星片產(chǎn)生的其他雜質與馬波沙星氧化物峰的分離度良好，試驗中采用了DAD檢測器，在298 nm的色譜圖上，馬波沙星氧化物的相對保留時間為1.5，光譜圖中馬波沙星氧化物的吸收峰值的位置與馬波沙星是相同的，用以上兩點可以區(qū)分馬波沙星氧化物和其他雜質，說明本分析方法可以較好地排除干擾，專屬性強。

2.5 檢測限 將1.2.6項中低濃度添加樣品逐步稀釋檢測，以信噪比為3∶1時馬波沙星氧化物的濃度作為檢測限(圖7)，檢測限為0.2 μg/mL。

2.6 定量限 將1.2.6項中低濃度添加樣品逐步稀釋檢測，以信噪比為10∶1時馬波沙星氧化物的濃度作為檢測限，定量限為0.5 μg/mL。

2.7 范圍 根據(jù)2.3、2.4、2.5、2.6項的結果分析，馬波沙星氧化物的濃度范圍在0.2～100 μg/mL范圍內均可獲得可靠結果。根據(jù)農業(yè)部2329號公告該物質的限度為不得過0.5%(W/W)，按1.2.4項方法配制樣品時，該限度在被測溶液中的濃度為1 μg/mL。因而，檢測限、定量限、限度均在檢測范圍之內。

圖1 馬波沙星氧化物圖譜(1 μg/mL)Fig 1 Marbofloxacin oxide chromatogram(1 μg/mL)

圖2 馬波沙星對照品圖譜(12 μg/mL)Fig 2 Marbofloxacin chromatogram (12 μg/mL)

圖3 馬波沙星與馬波沙星氧化物混合溶液圖譜(馬波沙星120 μg/mL、馬波沙星氧化物1 μg/mL)Fig 3 Marbofloxacin and Marbofloxacin oxide chromatogram(Marbofloxacin 120 μg/mL、Marbofloxacin oxide 1 μg/mL)

圖4 光照破壞馬波沙星片樣品圖譜Fig 4 Marbofloxacin tablets chromatogram

圖5 馬波沙星氧化物光譜Fig 5 Marbofloxacin oxide spectrogram

圖6 馬波沙星光譜Fig 6 Marbofloxacin oxide spectrogram

圖7 檢測限圖譜(0.2 μg/mL)Fig 7 limit of detection chromatogram(0.2 μg/mL)

2.8 耐用性 對流動相組成、緩沖液pH值、柱溫、流速、色譜柱的品牌、柱長等因素進行考察，發(fā)現(xiàn)流動相比例在±5%，緩沖液pH值在±0.2 pH單位內，檢測結果較為穩(wěn)定，流速、色譜柱的品牌、柱長對保留時間影響明顯，但馬波沙星氧化物的相對保留時間均在1.5左右。柱溫在±2 ℃范圍內，相對保留時間較為穩(wěn)定。

3 討 論

任何影響藥物純度的物質均可能具有潛在的生物活性，藥品在臨床使用中產(chǎn)生的不良反應除了與藥品本身的藥理活性有關外，與藥品中存在的雜質也有很大關系。因而在藥品生產(chǎn)和貯存過程中控制藥品中雜質的含量是非常必要的。在實際檢測工作中，要求雜質的檢測方法既能保證藥品質量可控，又能方便快捷地完成檢測工作。尤其在新產(chǎn)品、新劑型研發(fā)過程中根據(jù)每種藥物獨有的理化性質及穩(wěn)定性情況，研究制定適宜的雜質檢測方法成為質量標準研究的重要一環(huán)。馬波沙星經(jīng)加速和長期穩(wěn)定性試驗,在避光條件下保存具有較好的穩(wěn)定性[11-12]，但在光照條件下，會出現(xiàn)多種雜質，氧化物是最明顯的雜質，在查詢到的相關文獻中未見專門就馬波沙星氧化物與馬波沙星含量用高效液相色譜二極管陣列檢測器檢測結果的論述。本文的方法，用色譜圖中的保留時間,結合光譜圖最大吸收峰的位置,可以有效區(qū)分馬波沙星氧化物與其他雜質，因而用馬波沙星氧化物可以作為馬波沙星片穩(wěn)定性的標志物，通過控制馬波沙星氧化物的含量來控制馬波沙星片的雜質水平。由于馬波沙星氧化物與馬波沙星的結構十分相近[5]，發(fā)色基團是一致的，從本文的檢測結果可以證實：二者光譜圖基本一致，均在298 nm波長處有最大吸收，色譜圖中馬波沙星氧化物相對于馬波沙星的相對響應因子為1.03。所以分析后認為，在馬波沙星片有關物質的檢測中可以采用自身對照的方法來檢測并控制馬波沙星氧化物的含量，這樣更方便，更快速，可以避免馬波沙星氧化物對照品的購置，線性溶液的配制及繁瑣的計算。為避免在檢測過程中產(chǎn)品受光照的影響，建議在檢測過程中最好使用棕色容量瓶完成檢測。