尹伶靈,楊修鎮(zhèn),李有志，牛華星,劉少寧，陳玲

(山東省獸藥質(zhì)量檢驗(yàn)所,山東省畜產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)測(cè)與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,濟(jì)南 250022)

雞蛋富含優(yōu)質(zhì)蛋白以及豐富的維生素和礦物質(zhì)，是日常生活不可或缺的一種健康食品。由于不合理使用和濫用獸藥以及不遵守休藥期等原因，致使雞蛋中的各種藥物殘留(母體化合物和代謝物)頻頻檢出，其產(chǎn)生的危害不可忽視[1]。因此，雞蛋中的獸藥殘留越來(lái)越引起人們的廣泛關(guān)注。目前國(guó)內(nèi)外現(xiàn)有的雞蛋中多殘留檢測(cè)方法主要采用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[2-10]，存在檢測(cè)藥物的種類單一，前處理方法復(fù)雜，靈敏度低等缺點(diǎn)。本文選取了日常檢測(cè)中風(fēng)險(xiǎn)比較高的β-內(nèi)酰胺類、抗病毒類、大環(huán)內(nèi)酯類、喹諾酮類、四環(huán)素類、林可胺類、磺胺類、氯霉素類和氟蟲(chóng)腈及其代謝物共 9大類38種藥物，結(jié)合PRIME HLB快速通過(guò)式前處理技術(shù)，研究建立了超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜同時(shí)測(cè)定方法。該方法簡(jiǎn)單快速、靈敏度高、準(zhǔn)確性好，適用于大批量雞蛋樣品的高通量快速定性定量檢測(cè)，為雞蛋樣品的風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)提供了有力的技術(shù)手段。將該方法應(yīng)用于200批雞蛋風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)樣品的檢測(cè)，共檢出陽(yáng)性樣品10批，陽(yáng)性藥物有磺胺間甲氧嘧啶、磺胺甲噁唑、多西環(huán)素、替米考星、氧氟沙星、諾氟沙星、氟苯尼考，并將陽(yáng)性樣品通過(guò)國(guó)標(biāo)方法進(jìn)行復(fù)檢，結(jié)果吻合，進(jìn)一步證明了該方法的準(zhǔn)確性。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 Waters Xevo TQ-S高效液相-串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國(guó)Waters公司)，配有電噴霧電離接口(ESI)及Masslynx數(shù)據(jù)處理系統(tǒng); BT125D電子天平(感量0.01 g、 0.00001 g, 德國(guó)賽多利斯公司); Allegra64R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(美國(guó)貝克曼公司); XW-80A渦旋混合器(上海精科實(shí)業(yè)有限公司); HY-4調(diào)速多用振蕩器(北京踏錦科技有限公司); MilliPAK純水器(Millpore公司); Oasis PRiME HLB固相萃取柱(美國(guó)Waters公司)。

對(duì)照品：阿莫西林(德國(guó)Dr. Ehrenstorfer公司，批號(hào)：00907)，氨芐西林(德國(guó)Dr. Ehrenstorfer公司，批號(hào)：21108)，頭孢氨芐(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：130408-201411)，頭孢喹肟(中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，批號(hào)：K0320906)，頭孢噻呋(中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，批號(hào)：K0331408)，金剛烷胺(上海安普科學(xué)儀器有限公司，批號(hào)：A0309578)，泰樂(lè)菌素(中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，批號(hào)：K0161305)，替米考星(中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，批號(hào)：K0311407)，紅霉素(中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，批號(hào)：K40528)，恩諾沙星(中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，批號(hào)：H0081206)，環(huán)丙沙星(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：130451-201203)，沙拉沙星(中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，批號(hào)：H0181108)，達(dá)氟沙星(中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，批號(hào)：H0201210)，氧氟沙星(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：130454-201206)，培氟沙星(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：130459-201402)，諾氟沙星(中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，批號(hào)：H0071305)，洛美沙星(中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，批號(hào)：H0121505)，噁喹酸(德國(guó)Dr. Ehrenstorfer公司，批號(hào)：G142374)，土霉素(中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，批號(hào)：K0031208)，金霉素(中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，批號(hào)：0041110)，四環(huán)素(中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，批號(hào)：0011209)，多西環(huán)素(中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，批號(hào)：0131209)，林可霉素(中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，批號(hào)：0101503)，磺胺間甲氧嘧啶(中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，批號(hào)：C0031610)，磺胺二甲嘧啶(中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，批號(hào)：C0061007)，磺胺甲噁唑(中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，批號(hào)：H0261106)，磺胺二甲氧嘧啶(中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，批號(hào)：H0371406)，磺胺喹噁啉(中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，批號(hào)：H0251407)，磺胺氯吡嗪鈉(農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研檢測(cè)所，批號(hào)：SB06-087-2008)，磺胺氯達(dá)嗪鈉(農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研檢測(cè)所，批號(hào)：SB05-083-2008)，氯霉素(中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，批號(hào)：K0320906)，氟苯尼考(中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，批號(hào)：K0320906)，氟苯尼考胺(中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，批號(hào)：K0320906)，甲砜霉素(中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，批號(hào)：K0320906)，氟蟲(chóng)腈(美國(guó)A Chemtek. Inc.公司，批號(hào)：S880057)，氟甲腈(美國(guó)A Chemtek. Inc.公司，批號(hào)：S008833)，氟蟲(chóng)腈砜(美國(guó)A Chemtek. Inc.公司，批號(hào)：S011903)，氟蟲(chóng)腈硫醚(美國(guó)A Chemtek. Inc.公司，批號(hào)：S008647)。

乙腈(色譜純, 德國(guó)Merck公司)，甲醇 (色譜純, 德國(guó)Merck公司);甲酸(色譜純，美國(guó)Sigma-Aldrich公司)；水為超純水(自制)；乙二胺四乙酸鈉(EDTA)(分析純, 上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液 分別精密量取濃度為1000 μg/mL的氟蟲(chóng)腈和氟蟲(chóng)腈砜各1.00 mL，置于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液濃度為100 μg/mL；分別精密稱取0.01 g(精確至0.1 mg)標(biāo)準(zhǔn)品置于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液濃度為1 mg/mL，-20 ℃冰箱保存。

1.2.2 混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液 將各標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液稀釋，配成混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，各組分濃度為10 mg/L。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法 取5枚雞蛋混合均勻，稱取(2.00±0.02) g混勻的蛋液置于50 mL離心管內(nèi)，加入2 mL 0.02 mol/L EDTA溶液，渦旋1 min。再加入乙腈8 mL，漩渦震蕩提取1 min，超聲波萃取10 min，5000 r/min高速離心5 min，取5 ml上清液直接加載到6cc規(guī)格PRiME HLB固相萃取柱，無(wú)需活化和平衡，保持一秒一滴的流速，收集全部流出液，在40 ℃下氮?dú)獯抵两?，殘留液體用20%甲醇水溶液定容至1.00 mL，過(guò)0.2 μm微孔濾膜，上LC-MS/MS測(cè)試。

1.4 液相色譜條件 色譜柱為BEH C18(100 mm×2.1 mm,1.7 μm), 流動(dòng)相：正離子模式下，流動(dòng)相A:甲醇;流動(dòng)相B:0.1%甲酸水;負(fù)離子模式下：流動(dòng)相A:甲醇;流動(dòng)相B:水。流速:0.2 mL/min;進(jìn)樣量:1 μL;柱溫: 35 ℃。液相色譜梯度洗脫程序見(jiàn)表1。

表1 液相色譜梯度洗脫程序Tab 1 HPLC gradient elution program

1.5 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源;多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM);離子源溫度:150 ℃;脫溶劑溫度:400 ℃;脫溶劑氮?dú)饬魉?900 L/h;毛細(xì)管電壓:3 kV。所選擇的母離子、子離子、錐空電壓和碰撞能量等參數(shù)見(jiàn)表2。

表2 38種獸藥的MRM離子測(cè)定參數(shù)表Tab 2 Table of MRM ion monitor parameters of the 38 veterinary drugs

續(xù)表

續(xù)表

2 結(jié)果與分析

2.1 方法的回收率、精密度、檢出限和定量限 為降低基質(zhì)效應(yīng), 采用空白基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行定量，將雞蛋的提取液作為基質(zhì)本底液。在上述確定的優(yōu)化條件下，在雞蛋空白樣品中準(zhǔn)確加入混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用基質(zhì)匹配標(biāo)樣進(jìn)行定量，考察方法回收率、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差、檢出限(信噪比S/N=3)和定量限(信噪比S/N=10)。在雞蛋樣品中加入濃度為定量限、2倍定量限、5倍定量限的3個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，按上述方法對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)濃度做6個(gè)平行樣品，38種目標(biāo)分析物的各效能指標(biāo)驗(yàn)證結(jié)果如表3所示。從表3可以看出，38種待測(cè)物的加標(biāo)回收率為71.4%～108.2%，方法的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.7%～8.1%?？梢?jiàn)，該方法精密度良好，檢出限和回收率均能夠滿足多殘留樣品檢測(cè)的相關(guān)要求。

表3 雞蛋中38種藥物殘留的檢出限、定量限、平均加標(biāo)回收率及RSD(n=6)Tab 3 LODs, LOQs, average recoveries, and RSDs of the 38 veterinary drugs in eggs ( n=6)

2.2 實(shí)際樣品的測(cè)定 該方法用于檢測(cè)200批雞蛋樣品(采集自山東省各地市超市和農(nóng)貿(mào)市場(chǎng))，共檢出陽(yáng)性樣品10批，其中磺胺間甲氧嘧啶(0.57 μg/kg)、磺胺甲噁唑(1.20 μg/kg)、多西環(huán)素(兩批分別為4.33、22.31 μg/kg)、替米考星(兩批分別為8.93、6.46 μg/kg)、氧氟沙星(1.84 μg/kg)、諾氟沙星(7.53 μg/kg)、氟苯尼考(兩批分別為1.0、11.2 μg/kg)，并將陽(yáng)性樣品通過(guò)國(guó)標(biāo)方法進(jìn)行復(fù)檢，結(jié)果吻合，進(jìn)一步證明了該方法的準(zhǔn)確性(典型陽(yáng)性樣品的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)色譜圖見(jiàn)圖1)。

圖1 典型陽(yáng)性樣品的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)色譜圖Fig 1 MRM chromatogram of typical positive sample

3 討論與結(jié)論

3.1 色譜條件的優(yōu)化 本試驗(yàn)選用 Waters Acquity UPLC BEH C18(2.1 mm × 100 mm ×1.7 μm)色譜柱分離9類獸藥，此色譜柱對(duì)各化合物具有較強(qiáng)的保留，各色譜峰峰形較好，并可以得到有效的分離，減少了雜質(zhì)的干擾。本試驗(yàn)用甲醇作為強(qiáng)洗脫流動(dòng)相，在流動(dòng)相中加入甲酸能增加各種化合物在 ESI+模式下的離子化效率，改善各化合物的峰形。本試驗(yàn)分別配制0.05%、0.1%和0.2%甲酸水溶液作為流動(dòng)相，結(jié)果表明，0.1%甲酸水溶液體系能提供最佳的離子化條件，峰面積信號(hào)最強(qiáng)，靈敏度最高。在 ESI-模式下，用純甲醇和純水作為流動(dòng)相。

3.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化 在電噴霧質(zhì)譜模式下，分別對(duì)毛細(xì)管電壓、錐孔電壓、碰撞能量和選擇離子等進(jìn)行了充分的優(yōu)化，選取經(jīng)碰撞后所得豐度較高的2個(gè)子離子作為定量和定性離子，并確定其最佳碰撞能量的電壓值。依據(jù)子離子相對(duì)豐度比(定性離子/定量離子)和化合物保留時(shí)間進(jìn)行定性。理論上，MRM 采集模式可以同時(shí)對(duì)數(shù)十種化合物進(jìn)行定量分析。然而，同時(shí)測(cè)定的化合物數(shù)目越多，MRM 離子對(duì)通道也越多，分配給每個(gè) MRM 離子對(duì)通道的駐留時(shí)間越短，而離子駐留時(shí)間對(duì)檢測(cè)的靈敏度和準(zhǔn)確定量有較大影響。為了提供較高的檢測(cè)靈敏度和確保定量的準(zhǔn)確性，本文采用動(dòng)態(tài)多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式進(jìn)行數(shù)據(jù)的采集，在該采集方式下，MRM 離子對(duì)通道根據(jù)設(shè)定好的目標(biāo)物保留時(shí)間及相應(yīng)的時(shí)間窗口進(jìn)行有針對(duì)性的采集，而不在此保留時(shí)間段內(nèi)的藥物離子對(duì)不予采集，使采集效率得到極大提高。

3.3 樣品前處理方法的優(yōu)化 分別提取這9類化合物的方法已有許多報(bào)道[2-10]，但都不完全適用于這9類化合物的同時(shí)提取和凈化。由于這9類藥物多易溶于甲醇、乙腈等極性溶劑，本研究分別考察了90%甲醇水溶液，80%甲醇水溶液，90%乙腈水溶液，80%乙腈水溶液。實(shí)驗(yàn)證明, 乙腈的提取回收率和沉淀蛋白的效果好, 且重復(fù)性較好, 因而選用乙腈作為提取溶劑。通過(guò)考察90%乙腈水溶液，80%乙腈水溶液，發(fā)現(xiàn)除四環(huán)素類藥物和氟喹諾酮類藥物外，其他大部分藥物采用80%乙腈水溶液提取凈化后的回收率最高，穩(wěn)定性最好。根據(jù)文獻(xiàn)[9-10]，把提取液中所含的20%的水，用0.02 mol/L EDTA溶液來(lái)替代，發(fā)現(xiàn)大大提高了四環(huán)素和氟喹諾酮類藥物的回收率，其他7類藥物的提取回收率不受影響。

樣品凈化，本文采用的是Waters公司的Oasis PRiME HLB固相萃取小柱，與目前常用的凈化方法C18固相萃取小柱相比，它是簡(jiǎn)單的通過(guò)式凈化處理，無(wú)需任何活化和平衡，直接上樣, 簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)步驟, 減少了有機(jī)溶劑的使用量，使得樣品凈化過(guò)程簡(jiǎn)單、快速、有效[11-13]。PRiME HLB 固相萃取柱是基于 HLB 填料進(jìn)行的升級(jí)產(chǎn)品，屬于反相保留機(jī)理，對(duì)于脂肪、磷脂、色素具有很好的吸附作用，可以有效去除蛋白、鹽、磷脂等 95%以上的基質(zhì)干擾物。本研究采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC-MS/MS)，結(jié)合PRIME HLB快速通過(guò)式凈化方法，建立了同時(shí)提取、動(dòng)態(tài)多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(DMRM)同時(shí)測(cè)定β-內(nèi)酰胺類、抗病毒類、大環(huán)內(nèi)酯類、喹諾酮類、四環(huán)素類、林可胺類、磺胺類、氯霉素類和氟蟲(chóng)腈及其代謝物共 9 類 38種藥物殘留的新方法。該方法大大簡(jiǎn)化了前處理步驟、縮短了前處理時(shí)間、減少了溶劑用量, 同時(shí)質(zhì)控樣品回收率達(dá)到分析要求，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，適用于大批量雞蛋樣品的快速定性定量檢測(cè)。