蘭新財，葉志惠，歐 彬，趙麗麗，麻軍法，盧 駿

(浙江金大康動物保健品有限公司，浙江金華321016)

中醫(yī)認為，雄性動物性欲下降、精液質量差是因為肝腎不足，氣血虧損所致。許多補益肝腎的中藥如金匱腎氣丸、右歸丸等均有提高性欲、改善精液質量的作用。增精寶由黃芪、山藥、茯苓、車前子等組成，具有補腎填精、壯陽催情、補益氣血的作用。本試驗旨在利用環(huán)磷酰胺腹腔注射致炎癥動物模型，進而采用增精寶灌胃給藥，觀察小鼠的臨床表現(xiàn)、生長的影響，并通過精子密度和活率、精子凋亡狀態(tài)、組織形態(tài)學等方法檢測，探討兩種劑量濃度的增精寶對環(huán)磷酰胺導致小鼠生精障礙的保護作用。

1 材 料

1.1 試驗藥物 注射用環(huán)磷酰胺(由江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司提供，規(guī)格：0.2 g，批號：HA-30-01-728)。增精寶(由浙江金大康動物保健品有限公司提供，批號：20180508，試驗給藥劑量定為低劑量組0.6 g/kg·b.w.，高劑量組1.8 g/kg·b.w.)；本品由黃芪、山藥、茯苓、車前子等8味藥材，經兩次水提，濾過，減壓濃縮至1 mL相當于1 g原生藥。

1.2 試驗動物 試驗動物：ICR小鼠，SPF級，雄性，8～9 周齡，動物來源：南京市江寧區(qū)青龍山動物繁殖場提供，合格證SCXK(蘇)2017-0001。

1.3 試驗材料 異氟醚、生理鹽水、FITC Annexin V Apoptosis Detection KitⅠ(BD)、TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒(南京建成生物工程有限公司)、1%乳酸鈉水溶液、丙酮酸鈉、硫酸慶大霉素、酚紅、人血清白蛋白、HEPES、鼠糧、墊料、小鼠籠8個、水瓶、電子稱、灌胃針8號(直頭、彎頭)、注射器2 mL、200目尼龍網、打耳鉗、手術器械、量筒、乳膠手套、燒杯、解剖器械。

2 試驗方法

2.1 飼養(yǎng)管理 試驗動物飼養(yǎng)于清潔、安靜的環(huán)境中，環(huán)境溫度控制在20 ℃左右，自然光照，飼喂鼠全價顆粒料，自由采食和飲水。試驗前適應性飼養(yǎng)3 d，觀察其健康狀況，選擇健康、營養(yǎng)狀況良好的進行試驗。

2.2 試驗分組 40只雄性小鼠，隨機分為4組，依次為空白對照組(CG)、模型組(MG)、增精寶低劑量組(SG)、增精寶高劑量組(LG)。除空白對照組外，其余小鼠腹腔注射環(huán)磷酰胺50 mg/kg，連續(xù)注射7 d，空白對照組腹腔注射等量生理鹽水?？瞻讓φ战M和模型組每天灌服1% 羧甲基纖維素鈉0.2 mL；增精寶分別設低劑量組給予量和高劑量組給予量，各組小鼠連續(xù)給藥35 d。

2.3 常規(guī)觀察 分別于0(試驗開始)、7、14、21、28、35、42 d每天早上于固定時間點測定各組小鼠的飲食量、飲水量、體重，觀察小鼠外觀、精神狀態(tài)等變化情況。

2.4 睪丸指數(shù)、附睪指數(shù)、儲精囊指數(shù)和前列腺指數(shù)測定 小鼠末次給藥后12 h，禁食不禁水，稱量體重、眼球采血后，脫頸處死，剖取睪丸、附睪、儲精囊、前列腺，濾紙吸取表面殘血及多余水分，稱取濕重，計算睪丸指數(shù)、附睪指數(shù)、儲精囊指數(shù)和前列腺指數(shù)。

2.5 小鼠精子密度及精子活率的測定 雙側附睪置于潔凈培養(yǎng)皿中，用眼科剪沿附睪縱軸剪一刀使其分為大致均勻的2半，然后沿橫軸剪2刀使附睪分為大致均勻的6段，將剪碎的附睪組織移入預置常溫孵育緩沖液1 mL的試管中，然后用1 mL孵育緩沖液沖洗培養(yǎng)皿，沖洗液移入裝附睪的試管中。

摘取睪丸和附睪后，分離輸精管，于輸精管與附睪尾結合部、輸精管與前列腺結合部剪切離斷輸精管。用胰島素注射針抽取孵育緩沖液1 mL，沿輸精管一側斷端將針頭插入輸精管管腔內，輕推注射器，可見另一側斷端流出1～2滴乳白或灰白色液體，內含大量精子，將所得液體滴入裝附睪的試管中，并用注射器中剩余孵育緩沖液沖洗輸精管管腔，并將液體全部滴入裝附睪的試管中。將所得精子置于37 ℃恒溫孵育箱中孵育30 min備用。

精子于37 ℃恒溫孵育箱中孵育30 min后，小心吸取上層液體，1500 r/min離心5 min，沉淀物加入1 mL Bww高蛋白獲能液，置于37 ℃恒溫孵育箱中獲能2 h，取1滴滴入牛鮑氏血細胞計數(shù)板上，計算每毫升精子數(shù)，精液涂片，伊紅染色，進行精子活率測定(10 μL伊紅∶10 μL精子懸液，死精子頭部被染成紅色，活精子不著色，隨機觀察200個精子，計算存活率)。

2.6 小鼠睪丸各倍體生精細胞比例的影響 精子于37 ℃恒溫孵育箱中孵育30 min后，小心吸取上層液體，1500 r/min離心5 min，沉淀物加入PBS液洗滌、離心、去上清液，重復洗滌2次，用冷PBS液稀釋精子懸液，取1×106個精子于試管中，加PBS液洗滌、離心，管中，加入FITC-AnnexinV 10 μL和PI 0.3 μg染色，室溫下避光靜置15 min后加400 μL孵育緩沖液，用流式細胞儀檢測精子凋亡率，結果以AV/PI表示。

2.7 小鼠睪丸組織形態(tài)學觀察 取單側睪丸石臘切片，HE染色，光鏡觀察睪丸組織內精原細胞與各級生精細胞的分布。

3 結果與分析

3.1 臨床表現(xiàn) 試驗過程中，各組小鼠精神狀態(tài)良好，毛發(fā)順暢，采食飲水正常，糞便干燥無異常，未觀察到臨床可見的異常情況。小鼠體重量逐漸增加，體毛有光澤，活動敏捷，造模中后期相互打斗明顯，多數(shù)小鼠在尾部、背部可見明顯傷痕。試驗結束后，剖檢大體檢查，內臟器官均正常，未見到器官實質病變(圖1～圖4)。

3.2 體重的影響 試驗時隨機分成四組飼養(yǎng)并分別進行相關參數(shù)的統(tǒng)計。從表1可以看出，整個試驗過程中兩種劑量濃度的增精寶對環(huán)磷酸酰導致小鼠的增重有影響，從統(tǒng)計學角度來看，14、21 d期間體重差異顯著(P<0.05)，28 d后體重差異不顯著。表明與對照組相比腹腔注射環(huán)磷酰胺導致其余三組小鼠體重增長幅度明顯下降(圖5)。

表1 對小鼠體重的影響Tab 1 Effects on body weight of mice

*與空白組差異顯著(P<0.05)；**與空白組差異極顯著(P<0.01)

*There was a significant difference between control group*(P<0.05),**control group (P<0.01)

圖1 局部解剖(從左到右：空白組、模型組、低劑量組、高劑量組)Fig 1 Local anatomy (from left to right: control group, model group, low dose group, high dose group)

圖2 生殖系統(tǒng)大體解剖Fig 2 General anatomy of the reproductive system

圖3 四組睪丸形態(tài)大小變化Fig 3 Changes of testicular morphology and size in four groups

圖4 四組儲精囊、前列腺、膀胱形態(tài)大小變化Fig 4 Morphological and size changes of seminal vesicle, prostate and bladder in four groups

圖5 小鼠體重變化趨勢圖Fig 5 Trend Chart of Weight Change in Mice

3.3 對器官指數(shù)的影響 將兩種劑量的增精寶連續(xù)給小鼠灌胃5周后，進行剖檢測定生殖器官(附睪、睪丸、儲精囊和前列腺)指數(shù)，結果見表2～表3。由表可見，低劑量組與模型組對小鼠的附睪、睪丸、儲精囊和前列腺的器官指數(shù)均低于空白組，但高劑量組對小鼠的附睪、睪丸、儲精囊和前列腺均有較顯著的促進作用，但對前列腺的影響較小。

3.4 小鼠精子密度及精子活率的測定 結果見表4。

3.5 小鼠睪丸各倍體生精細胞比例的影響(對精子行FITC-AV/ PI 染色后用流式細胞儀檢測精子凋亡率) 從表5中可以看出，模型組和低劑量組小鼠精子凋亡率顯著高于對照組小鼠，而高劑量組小鼠精子凋亡率與對照組小鼠無顯著差異(圖6)。

3.6 對小鼠睪丸組織形態(tài)學的影響 HE結果表明空白組小鼠生精小管管腔飽滿，生精上皮外的界膜均勻、完整；生精上皮厚度適中，可見不同發(fā)育階段的生精細胞及成熟的精子；管腔內可見密度適當?shù)木樱徊G丸間質細胞排列均勻，疏松結締組織中微血管豐富；TUNEL結果表明空白組睪丸生精小管中凋亡精子數(shù)目很少，且結構特征與HE一致(圖7)。

表2 對小鼠生殖器官指數(shù)的影響Tab 2 Effect on Reproductive Organ Index in Mice

表3 對小鼠生殖器官尺寸大小的影響Tab 3 Effect on the Size and Size of Reproductive Organs in Mice

*與空白組差異顯著(P<0.05)

*Significant difference was found compared with control group (P<0.05)

表4 小鼠精子密度及活動能力比較Tab 4 Comparison of sperm density and motility in mice

*與空白組差異顯著(P<0.05)；**與空白組差異極顯著(P<0.01)

*There was a significant difference compared with control group (P<0.05),**There was a significant difference compared with control group (P<0.01)

表5 精子凋亡率( ± SD)Tab 5 Sperm Apoptosis Rate

*與空白組差異顯著(P<0.05)；**與空白組差異極顯著(P<0.01)

*There was a significant difference compared with control group (P<0.05),**There was a significant difference compared with control group (P<0.01)

圖6 四組小鼠附睪精子細胞凋亡情況Fig 6 Apoptosis of Sperm Cells in Epididymis of Mice in 4 groups

圖7 空白組睪丸組織(HE；TUNEL)Fig 7 Testicular tissue of blank group (HE; TUNEL)

模型組小鼠睪丸變形、塌陷的生精小管數(shù)量增多；界膜變薄，部分脫落；生精小管上皮變薄，各級生精細胞數(shù)量顯著減少；管腔面精子數(shù)量顯著減少甚至沒有；多數(shù)生精小管可見生精細胞脫落及排列紊亂；睪丸間質細胞排列稀疏；該組睪丸生精小管稀疏，且管腔內有強陽性反應，但生精小管中精子數(shù)量極少(圖8)。

圖8 模型組睪丸組織(HE；TUNEL)Fig 8 Testicular tissue of model group (HE; TUNEL)

低劑量組小鼠睪丸生精小管管腔較大，管腔內存在少量的精子，各級生精細胞數(shù)目顯著減少，睪丸間質細胞排列適中；該組生精上皮呈弱陽性，管腔有部分弱陽性凋亡精子(圖9)。

圖9 低劑量組睪丸組織(HE；TUNEL)Fig 9 Testicular tissue in low dose group (HE; TUNEL)

高劑量組小鼠睪丸生精小管較為飽滿，管腔內存在大量精子，生精上皮較厚，可見各級生精細胞排列整齊，界膜明顯，睪丸間質細胞排列整齊；生精上皮含有部分凋亡細胞，而管腔呈陰性(圖10)。

圖10 高劑量組睪丸組織(HE；TUNEL)Fig 10 Testicular tissue of high dose group (HE; TUNEL)

4 討論與結論

機體生殖系統(tǒng)擔負著調節(jié)生命體多種生理功能的任務，對保證其正常的生理活動至關重要。雄性的生殖系統(tǒng)包括成對的睪丸、附睪、輸精管、副性腺及單一的尿生殖道、陰莖等器官。其主要功能是產生、儲存、運送精子。精子以及精液的生物學功能的破壞直接導致雄性不育的危害疾病。本研究通過腹腔注射環(huán)磷酰胺制造小鼠生精障礙動物模型，其后經灌胃增精寶研究該藥物對環(huán)磷酰胺致小鼠生精障礙的治療及保護作用。

環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide，CP)是一種細胞毒性化療藥物，可破壞DNA結構，阻斷復制，從而導致細胞死亡。因環(huán)磷酰胺具有較強的免疫抑制作用，故在免疫毒理學中是制備免疫抑制模型的常用陽性物[1-2]。

賈慶軍[3]等對雄性小鼠進行腹腔注射環(huán)磷酰胺30 mg/kg藥物，持續(xù)注射5 d，到第28天收集成對的附睪和睪丸，發(fā)現(xiàn)小鼠精子的畸形率明顯升高，表明腹腔注射環(huán)磷酰胺對小鼠生精細胞具有損傷的功能。本研究結果表明，以50 mg/kg腹腔注射環(huán)磷酰胺，連續(xù)注射7 d，收集附睪液制成精子涂片發(fā)現(xiàn)模型組小鼠精子畸形率較高，表明造模成功，然后再以低劑量和高劑量增精寶灌胃治療小鼠，與空白組相比，低劑量與高劑量增精寶組精子畸形率較低。

Kim等[4]每天給大鼠注射100 mg/kg環(huán)磷酰胺，連續(xù)給藥56 d后檢測大鼠睪丸毒性參數(shù)，發(fā)現(xiàn)大鼠的睪丸和附睪精子數(shù)均減少，附睪精子活力明顯下降，精母細胞液泡化。這些動物實驗證明環(huán)磷酰胺能夠對小鼠睪丸和附睪造成一定的生殖障礙。Li等[5]和Aghaie等[6]均采用腹腔注射的給藥方式給大鼠注射環(huán)磷酰胺，用兩種措施即每日20 mg/kg和一次性注射100 mg/kg，均發(fā)現(xiàn)大鼠的睪丸相對重量、睪酮水平和附睪精子數(shù)均明顯下降，因此環(huán)磷酰胺對大鼠睪丸具有較強的毒性作用。本試驗中，腹腔注射環(huán)磷酰胺，連續(xù)7 d，導致小鼠體重明顯低于空白組小鼠體重，隨后經增精寶藥物的不同劑量灌胃后模型組、低劑量組、高劑量組與空白組小鼠體重有明顯差異。高劑量組對小鼠的附睪、睪丸、儲精囊和前列腺的器官指數(shù)均有較顯著的促進作用。

羅少波等[7]給昆明雄性小鼠腹腔注射環(huán)磷酰胺60 mg/kg，每天1次，連續(xù)5 d，在34 d對睪丸做組織病理切片進行形態(tài)學觀察，發(fā)現(xiàn)塌陷的生精小管數(shù)量增多，上皮變薄，各級生精小管數(shù)量顯著減少，管腔精子數(shù)量顯著減少。并對小鼠精子進行精液常規(guī)分析，發(fā)現(xiàn)精子密度、活力、成活率均下降，由此可知腹腔注射環(huán)磷酰胺可增加小鼠的精子凋亡率，生精功能降低。高學勇[8]等給SD大鼠腹腔注射環(huán)磷酰胺20 mg/kg，每天1次，連續(xù)5 d，用藥兩個月后，用HE染色法制片觀察形態(tài)，并用原位缺口末端標記法(TUNEL法)檢測細胞凋亡。研究發(fā)現(xiàn)大鼠的生精小管直徑縮小，間距增寬，生精細胞的數(shù)目減少，生精小腔內大多未見精子形成，腔內精子稀少，含有大量脫落細胞，生精細胞凋亡增多，通過TUNEL法檢測發(fā)現(xiàn)，環(huán)磷酰胺可引起各階段生殖細胞凋亡，但以Ⅰ-Ⅳ和Ⅺ-Ⅱ階段的精原細胞和精母細胞最為顯著。張長城等[9]腹腔注射環(huán)磷酰胺50 mg/kg于小鼠體內，每日1次，連續(xù)7 d，測定小鼠生殖器官重量、精子密度與存活率、生精細胞各倍體比例。研究表明小鼠睪丸和附睪重量明顯低于正常小鼠，精子密度和存活率顯著降低，精原細胞和精子細胞百分比下降，初級精母細胞顯著升高，注射環(huán)磷酰胺后小鼠生殖器官重量下降，初級精母細胞和精子顯著降低，影響小鼠生精能力。本實驗中，對各組小鼠睪丸組織病理切片進行觀察發(fā)現(xiàn)，空白組小鼠睪丸生精小管管腔飽滿，生精上皮外的界膜均勻、完整；生精上皮厚度適中，可見不同發(fā)育階段的生精細胞及成熟的精子；管腔內可見密度適當?shù)木樱徊G丸間質細胞排列均勻，疏松結締組織中微血管豐富。模型組小鼠睪丸組織塌陷的生精小管數(shù)量增多，上皮變薄，各級生精小管數(shù)量顯著減少，管腔精子數(shù)量顯著減少；低劑量組小鼠睪丸組織排列適中，各生精小管管腔較大，內含少量精子，生精上皮較薄；高劑量組小鼠睪丸生精小管較為飽滿，管腔內存在大量精子，生精上皮較厚，可見各級生精細胞排列整齊，界膜明顯，睪丸間質細胞排列整齊。

環(huán)磷酰胺腹腔注射后，模型組小鼠出現(xiàn)精子密度、活力和活率明顯下降，而精子凋亡率顯著增加，與空白組小鼠相比有顯著差別，與病理檢查結果相符合，出現(xiàn)明顯的少弱精癥表現(xiàn)。另模型組小鼠在實驗中還出現(xiàn)精神萎靡、活動減少、惡寒、體毛稀疏、無光澤等類似于中醫(yī)“腎虛”的癥狀和體征。

環(huán)磷酰胺的生殖毒性很強，如何降低其毒性是當今熱議的話題。黃威峰等[10]通過實驗發(fā)現(xiàn)五子衍宗方可通過減少環(huán)磷酰胺造成的睪丸生殖細胞凋亡使其藥物毒性降低。郭錫春等[11]發(fā)現(xiàn)海參精囊提取物可提高環(huán)磷酰胺所致的睪酮分泌降低，保護受損的生殖功能。楊金鳳[12]發(fā)現(xiàn)姜黃素可通過抑制睪丸氧化損傷，提高抗氧化能力來降低環(huán)磷酰胺毒性。同時菟絲子水提取液、CMTM2、淫羊藿總黃酮等都對環(huán)磷酰胺的毒性具有拮抗作用，使其損傷減弱。

增精寶由黃芪、山藥、茯苓、車前子等組成，具有補腎填精、壯陽催情、補益氣血的作用，具有提高性欲、改善精液質量的作用。增精寶兩種劑量均能夠顯著的促進環(huán)磷酰胺導致小鼠生精障礙的保護作用，高劑量組對雄性小鼠的作用尤為顯著，可能與增精寶補腎填精、壯陽催情、補益氣血的功效相關。

通過試驗表明：對于小鼠體重的影響，14、21 d期間體重差異顯著(P<0.05)，28 d后體重差異不顯著。表明與空白組相比腹腔注射環(huán)磷酰胺導致其余三組小鼠體重增長幅度明顯下降；對于小鼠器官指數(shù)的影響，低劑量組與模型組對小鼠的附睪、睪丸、儲精囊和前列腺的器官指數(shù)均低于空白組，但高劑量組對小鼠的附睪、睪丸、儲精囊和前列腺均有較顯著的促進作用；對于小鼠精子密度及精子活率的影響，與空白組比較，低劑量組精子總密度和精子活率均差異顯著(P<0.05)；高劑量組精子總密度差異不顯著(P>0.05)，精子活率差異顯著(P<0.05)；對小鼠睪丸各倍體生精細胞比例的影響，模型組和低劑量組小鼠精子凋亡率顯著高于空白組小鼠，而高劑量組小鼠精子凋亡率與空白組小鼠無顯著差異；對小鼠睪丸組織形態(tài)學的影響，低劑量組小鼠睪丸組織排列適中，各生精小管管腔較大，內含少量精子，生精上皮較?。桓邉┝拷M小鼠睪丸生精小管較為飽滿，管腔內存在大量精子，生精上皮較厚，可見各級生精細胞排列整齊，界膜明顯，睪丸間質細胞排列整齊。

增精寶兩種劑量均能夠顯著的促進環(huán)磷酰胺導致小鼠生精障礙的保護作用，高劑量組對雄性小鼠的作用尤為顯著。這說明兩種劑量的增精寶對小鼠生殖系統(tǒng)的調節(jié)作用受劑量的影響較大，在一個合理的劑量范圍內能表現(xiàn)出強大的生精刺激作用。