何斌，張海靜，楊文海，邵志勇，吳利軍，陳夏冰，陳潔，金爾光，操繼躍

(1. 武漢市農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所，武漢 430208；2. 華中農(nóng)業(yè)大學，武漢 430070；3.天津市寶坻區(qū)畜牧水產(chǎn)業(yè)發(fā)展服務中心，天津 301800)

牛蒡子是一種常用中藥，具有疏散風熱、宣肺透疹功效，臨床上用于治療外感風熱、咳嗽氣喘、咽喉腫痛等癥[1]。牛蒡苷元為牛蒡子和牛蒡子提取物的直接有效成分[2]，具有抗炎、抗病毒、抗腫瘤、抗糖尿病等眾多藥理作用[3-4]，具有良好的研發(fā)和應用前景；根據(jù)獸藥長期毒性試驗指導原則的方法要求[5]，研究了牛蒡子水提物在Wister大鼠體內經(jīng)口給藥后的30 d長期毒性，確定牛蒡子提取物對大鼠的毒性作用性質和靶器官，評價其亞慢性攝入的危險性，為臨床試驗劑量設計及觀察指標的選擇提供參考，為新獸藥的研發(fā)和臨床用藥提供理論資料，為中獸藥現(xiàn)代化進行有意義的探索。

1 材 料

1.1 儀器設備 注射器、燒杯、小鼠灌胃針；小鼠獨立送風(IVC)系統(tǒng)；手術剪、鑷子，JY2002型電子天平、島津AUY2002型分析天平，日立7020型全自動生化分析儀，邁瑞B(yǎng)C-2600全自動血液分析儀。

1.2 藥品與試劑 牛蒡子提取物粉：含牛蒡苷元3.03%，由實驗室自制，使用時，用0.5%羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)溶液配制成混懸液；

羧甲基纖維素鈉：由國藥集團化學試劑有限公司生產(chǎn)，使用時，用蒸餾水配制成0.5%的水溶液，放置于4 ℃冰箱內，限7 d內使用；

甲醛：由國藥集團化學試劑有限公司生產(chǎn)，使用時用蒸餾水配制成10%的福爾馬林溶液，用于固定組織。

對照品的配制：0.5%羧甲基纖維素鈉，準確稱取0.5 g羧甲基纖維素鈉，溶解于100 mL蒸餾水中，作為對照品，保存于4 ℃冰箱內，限7 d內使用。

供試品的配制：準確稱取牛蒡子粉3.75、7.5、15.0 g，溶解于50 mL的0.5%羧甲基纖維素鈉溶液中，配成均勻混懸液，濃度分別為0.075、0.15、0.3 g/mL，對應的劑量分別為1.5、3、6 g/kg.bw，現(xiàn)配現(xiàn)用，灌胃前充分搖勻。

1.3 試驗動物 SPF級Wistar大鼠，80只，雌雄各半，4～6周齡，體重80～100 g，差異不超過平均體重的20%。大鼠由華中科技大學實驗動物中心提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(鄂)2010-0009。大鼠購買后在實驗室動物房內預飼養(yǎng)一周，飼喂不含任何藥物的全價營養(yǎng)顆粒飼料。實驗動物使用許可證號：SYXK(鄂)2014-0081。實驗動物的飼養(yǎng)與管理嚴格按照《實驗動物飼養(yǎng)與使用原則》的要求進行，整個試驗過程中保持室內清潔衛(wèi)生，空氣流通。

2 方 法

2.1 動物分組 將80只Wistar大鼠隨機分為4組，即空白對照組和牛蒡子粉低、中、高三個劑量組，每組20只，雌雄各半。大鼠每籠2只，雌雄分開，飼養(yǎng)在不銹鋼籠中，自由飲水和采食。室溫控制在20～25 ℃，相對濕度40%～70%，照明采用人工晝夜，12 h照明(早7點～晚7點)，12 h黑暗(晚7點～早7點)，每日更換新鮮自來水，每周更換2次墊料。

2.2 劑量設計 根據(jù)《獸藥研究技術指導原則》，對于求不出LD50且靶動物可能攝入量較大，劑量設計無法達到靶動物可能攝入量100倍的藥物，高劑量組可以按最大耐受量設計?；诖?，由于牛蒡子粉最大溶解濃度及大鼠灌胃體積的限制，將高劑量組設計為6 g/kg.bw(牛蒡子粉的最大可溶解濃度0.3 g/mL，大鼠灌胃體積2 mL/100g.bw)。根據(jù)低劑量組應高于藥效學有效劑量，結合《中華人民共和國獸藥典》和藥效學資料，設計低劑量組劑量為1.5 g/kg.bw。在高、低劑量組之間按劑量比設計中劑量組劑量為3 g/kg.bw。

2.3 給藥方法及時間 灌胃給藥，各劑量組采取等體積不等濃度的給藥方式，給藥過程中始終進行攪拌以保證藥液均勻。對照組給予等體積的0.5%羧甲基纖維素鈉。每周給藥7 d，每天給藥1次，每周根據(jù)體重變化調整1次給藥量，給藥期限為30 d。

2.4 觀察指標

2.4.1 一般臨床癥狀 每天觀察各組大鼠的一般生理指標，主要包括外觀體征和行為活動，如精神狀態(tài)、采食量和飲水量、體重變化、糞便顏色與性狀、腺體分泌、呼吸狀況、中毒癥狀和死亡情況等。如果發(fā)現(xiàn)異常，如過度興奮、躁動、驚跳、肌肉麻痹或震顫、精神萎靡、蜷縮不動、步態(tài)異常、皮毛污穢或死亡等情況，均應進行詳細記錄并處理。若在試驗過程中發(fā)現(xiàn)瀕死或死亡大鼠，詳細記錄大鼠死亡前的異常表現(xiàn)及死亡時間，并分析死亡原因是否為藥物引起[6-7]。

2.4.2 體重和進食量 每周日記錄大鼠體重，并根據(jù)體重調整大鼠給藥量，每周一開始按調整后的劑量給藥。

每周日稱量動物的給料量和剩余量，計算動物的進食量及飼料利用率。在實驗過程中，除每周日外，其余時間若發(fā)現(xiàn)飼料不夠，可隨時添加飼料，并如實記錄。

2.4.3 血液學檢查 試驗結束時進行血液學檢查。采血前對各劑量組大鼠禁食16 h，3%戊巴比妥鈉溶液(80 mg/kg.bw)麻醉，腹主動脈采血2 mL。采集的血樣于血細胞分析儀上檢測紅細胞(RBC)、白細胞(WBC)、血紅蛋白(HGB)、血小板(PLT)、淋巴細胞(LY)、單核細胞(MO)等血液學指標[8]。

2.4.4 血液生化檢查 試驗結束時測定血液生化指標。3%戊巴比妥鈉溶液(80 mg/kg.bw)麻醉，腹主動脈采血2 mL，將采集血液呈45～60度角于4 ℃冰箱放置1 h，3000 r/min離心5 min分離血清，于生化自動分析儀上測定血清中的谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)、血清白蛋白(ALB)、總蛋白(TP)、尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)、血糖(Glu)、總膽固醇(TCH)和甘油三酯(TG)等指標[9]。

2.4.5 臟器重量和臟/體比值 采血后處死動物，解剖，肉眼觀察每只動物心、肝、脾、肺、腎、胃腸等胸腹腔內器官有無顏色改變以及滲出、水腫、增生、萎縮等病變，做好記錄。用眼科鑷和眼科剪分離心、肝、脾、肺、腎、胃腸、睪丸(雄性)子宮(雌性)、卵巢(雌性)等臟器，清除干凈各臟器周圍結締組織和脂肪組織，用電子天平逐一稱重(胃腸除外)，計算臟/體比值，再用10%福爾馬林溶液立即固定[10]。

2.4.6 病理組織學檢查 病理切片檢查：若大體解剖肉眼未見異常，選取高劑量組和陰性對照組作病理切片。選取高劑量組和陰性對照組各20只動物(雌雄各半)的部分臟器(肝臟 、脾臟、腎臟、胃腸、卵巢和睪丸)，取材后，常規(guī)脫水、透明、浸蠟、制片及HE染色，在光學顯微鏡下由低倍至高倍觀察各組織的形態(tài)學變化，并詳細記錄描述所觀察到的形態(tài)學變化[11]。

病理結果評價標準：與陰性對照組比較，以鏡下形態(tài)學變化進行描述判斷。

病理組織學觀察：依各臟器形態(tài)學結構各異，但主要是以細胞變性作為觀察指標，并根據(jù)病理改變程度“-”、“+”“++”、“+++”量化，本試驗所獲數(shù)據(jù)采用非參數(shù)統(tǒng)計法(Nonparametric statistic)進行病理改變的評價。細胞變性及細胞壞死評價分級如表1、表2所示。

表1 細胞變性評價表Tab 1 Evaluation table of cell degeneration

表2 細胞壞死評價表Tab 2 Evaluation sheet for cell necrosis

2.5 統(tǒng)計分析 實驗數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel軟件建立數(shù)據(jù)庫，對大鼠的體重、采食量、各項血液學指標及臟/體比值進行統(tǒng)計處理，并列表說明。各項數(shù)據(jù)以“平均數(shù)±標準差”表示，計量資料采用方差檢驗，計數(shù)資料采用非參數(shù)檢驗，并按動物性別分別統(tǒng)計。

3 結果與分析

3.1 一般觀察 試驗期間每天觀察大鼠的行為活動，各劑量組大鼠均無死亡現(xiàn)象，精神狀態(tài)良好，活動正常，未出現(xiàn)過度興奮、躁動、精神萎靡、步態(tài)異?；蛳袤w分泌異常等現(xiàn)象，被毛整潔有光澤，無脫毛現(xiàn)象，糞便顏色、硬度均正常。

3.2 對大鼠體重、進食量及飼料利用率的影響 在試驗觀察期內，高劑量組的每周體重及進食量與中、低劑量組及空白對照組相差異不顯著(P>0.05)。各劑量組雌鼠與雄鼠飼料利用率隨著時間的增長而逐漸降低，開始階段雌鼠與雄鼠體重相差不大，飼料利用率比較接近，后來由于雄鼠進食量大、體重增長快，飼料利用率高于雌鼠，但雌雄各劑量組大鼠飼料利用率與空白對照組相比差異不顯著(P>0.05)，見表3、表 4、表 5。

表3 牛蒡子粉對大鼠體重的影響Tab 3 The impact of arctii fructus powder on body weight of

各劑量組與空白對照組比較，P>0.05

each dose group compared with the control group,P>0.05

表4 牛蒡子粉對大鼠進食量的影響Tab 4 The impact of arctii fructus powder on intake of

各劑量組與空白對照組比較，P>0.05

each dose group compared with the control group,P>0.05

表5 牛蒡子粉對大鼠飼料利用率的影響Tab 5 The impact of arctii fructus powder on food utilization of

各劑量組與空白對照組比較，P>0.05

each dose group compared with the control group,P>0.05

3.3 對大鼠增重、總進食量、總飼料利用率的影響

在試驗觀察期內，中、高劑量組大鼠體重總增重與總進食量略低于低劑量組與空白對照組，但差異不顯著(P>0.05)。雌、雄大鼠各劑量組總飼料利用率與空白對照組比較差異不顯著(P>0.05),見表6。

表6 牛蒡子粉對大鼠增重與總飼料利用率的影響Tab 6 The impact of arctii fructus powder on weight gain and feed utilization rate of

各劑量組與空白對照組比較，P>0.05

each dose group compared with the control group,P>0.05

3.4 血液學檢查結果 在試驗結束時對各劑量組大鼠進行血液學檢查，檢查結果表明雌、雄大鼠各劑量組血常規(guī)、血生化各項指標與空白對照組相比差異均不顯著(P>0.05)，且均在正常值范圍之內,見表7、表8、表9。

3.5 對大鼠臟器重量與臟/體比值的影響 試驗結束時對大鼠各主要臟器進行稱重并計算臟/體比值，結果表明雌、雄大鼠高、中、低劑量組與空白對照組比較臟器重量、臟/體比值差異均不顯著(P>0.05)，且均在正常值范圍之內,見表10。

表7 牛蒡子粉對大鼠血常規(guī)檢查結果的影響Tab 7 The impact of arctii fructus powder on blood routine examination results of

各劑量組與空白對照組比較，P>0.05

each dose group compared with the control group,P>0.05

表8 牛蒡子粉對大鼠白細胞分類的影響Tab 8 The impact of arctii fructus powder on classification of leukocytes in

各劑量組與空白對照組比較，P>0.05

each dose group compared with the control group,P>0.05

表9 牛蒡子粉對大鼠血液生化的影響Tab 9 The impact of arctii fructus powder on blood biochemistry of

各劑量組與空白對照組比較，P>0.05

each dose group compared with the control group,P>0.05

續(xù)表9 牛蒡子粉對大鼠血液生化的影響Tab 9 The impact of arctii fructus powder on blood biochemistry of

各劑量組與空白對照組比較，P>0.05

each dose group compared with the control group，P>0.05

表10 牛蒡子粉對大鼠臟器重量和臟/體比值的影響Tab 10 The impact of arctii fructus powder on organ weight and organ/body ratio of

各劑量組與空白對照組比較，P>0.05

each dose group compared with the control group,P>0.05

續(xù)表10 牛蒡子粉對大鼠臟器重量和臟/體比值的影響Tab 10 The impact of arctii fructus powder on organ weight and organ/body ratio of

各劑量組與空白對照組比較，P>0.05

each dose group compared with the control group,P>0.05

續(xù)表10 牛蒡子粉對大鼠臟器重量和臟/體比值的影響Tab 10 The impact of arctii fructus powder on organ weight and organ/body ratio of rats

各劑量組與空白對照組比較，P>0.05

each dose group compared with the control group,P>0.05

3.6 病理組織檢查 試驗結束時對大鼠進行大體解剖，肉眼觀察各劑量組及空白對照組大鼠的心、肝、脾、肺、腎及胃腸等胸腹腔主要臟器有無病變，發(fā)現(xiàn)各臟器的大小、形態(tài)及外觀顏色均正常，無充血、淤血現(xiàn)象，臟器表面無出血點及壞死灶，亦無明顯萎縮、增生、滲出、水腫及潰爛等病變(圖1)。

圖1 部分大體解剖圖片F(xiàn)ig 1 Partial gross anatomy

大體解剖未見肉眼可見病變，故對高劑量組及對照組大鼠做組織切片進行鏡下觀察，每組20只，雌雄各半。若高劑量組組織切片可見明顯病變，再對中、低劑量組進行組織切片觀察。

鏡下所見：見表11-表14，圖2-圖5。

組織切片觀察沒有發(fā)現(xiàn)明顯中毒性病理變化。部分大鼠肝臟切片可見肝細胞輕微脂肪變性、點狀壞死及肝竇內炎性細胞浸潤，個別肝臟出現(xiàn)肝細胞凝固性壞死；部分大鼠存在腎小球球系膜增生，間質內少量炎性細胞浸潤；個別大鼠脾臟存在炎性細胞浸潤；胃腸、卵巢、睪丸等均未出現(xiàn)病變。

圖2 (♂高7)： 肝細胞輕度脂肪變性Fig 2 (♂High 7)liver cells have slight steatosis

圖3 (♀高6)：肝細胞點狀壞死，炎性細胞浸潤Fig 3 (♂High 6)Note the spotty necrosis of hepatocytes with inflammatory cell infiltration

圖4 (♀高3)：肝細胞脂肪變性，肝竇擴張Fig 4 (♂High 3)Hepatocyte steatosis and hepatic sinus dilation

圖5 (♀高6)：腎小球球系膜增生，少量炎性細胞浸潤Fig 5 (♀High 6)Glomerular mesangial hyperplasia with a small amount of inflammatory cell infiltration

4 討論與結論

4.1 劑量設計 本試驗采用SPF級Wister大鼠進行牛蒡子粉經(jīng)口給藥30 d長期毒性研究，以2 mL/100 g.bw等體積不等濃度灌胃給藥，每天1次，連續(xù)30 d。由于藥物急性毒性試驗無法求出LD50，以及藥物最大溶解度的限制，高劑量組無法達到靶動物可能攝入量的100倍，根據(jù)《獸藥研究技術指導原則》，高劑量組以最大耐受量設計，故將高劑量組設計為6 g/kg.bw(牛蒡子粉的最大濃度0.3 g/mL，大鼠灌胃體積2 mL/100g.bw)，低劑量組應高于藥效學有效劑量，結合獸藥典及藥效學資料，將低劑量組灌胃劑量設計為1.5 g/kg.bw，在高、低劑量組之間按劑量比設計中劑量組為3 g/kg.bw(獸藥研究技術指導原則匯編2012)。

表11 牛蒡子粉對大鼠肝臟病理組織學檢查結果(n=10)Tab 11 The impact of arctii fructus powder on liver histopathological examination results

表12 牛蒡子粉對大鼠腎臟病理組織學檢查結果(n=10)Tab 12 The impact of arctii fructus powder on kidney histopathological examination results

表13 牛蒡子粉對大鼠脾臟病理組織學檢查結果(n=10)Tab 13 The impact of arctii fructus powder on spleen histopathological examination results

表14 牛蒡子粉對大鼠各臟器病理組織學檢查積分表Tab 14 The impact of arctii fructus powder on integral histopathological examination results

4.2 對體重和進食量的影響 試驗期間各劑量組大鼠的采食、飲水、活動均正常，未出現(xiàn)異常癥狀和死亡現(xiàn)象，進食量和體重均正常增長，雄鼠體重增長速度明顯高于雌鼠，符合大鼠生長規(guī)律。中、高劑量組大鼠體重總增重與總進食量略低于低劑量組與空白對照組，可能是由于藥物濃度過高，制成的混懸液過于黏稠，不容易消化，給胃造成機械負擔導致吸收障礙，從而影響大鼠進食與增重，但與對照組相比差異不顯著(P>0.05)。結合體重與進食量計算出大鼠飼料利用率，給藥組與對照組相比差異也不顯著(P>0.05)，說明牛蒡子粉對消化系統(tǒng)影響不大，不會對大鼠的正常生長產(chǎn)生影響。

4.3 對血常規(guī)的影響 血常規(guī)檢驗有助于在早期對全身性疾病進行診斷，主要包括紅細胞、血紅蛋白、網(wǎng)織紅細胞、白細胞、血小板及白細胞分類等項目。在研究牛蒡子粉的毒性時對血常規(guī)進行檢測有助于對藥物進行毒理學評價[12]。在本試驗對大鼠進行血常規(guī)的檢測結果中，給藥組與空白組各項指標值相比差異均不顯著(P>0.05)，且數(shù)值均在大鼠正常生理值范圍內，說明牛蒡子粉對大鼠血液學指標無影響。

4.4 對血液生化指標的影響 本試驗主要對大鼠肝功能、腎功能、血糖、血脂等指標進行了檢測。肝功能檢測的指標包括血漿總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、白蛋白/球蛋白(ALB/GIO)、丙氨酸氨基轉移酶(ALT)與天冬氨酸氨基轉移酶(AST)。血漿中白蛋白和大部分球蛋白是由肝臟合成的，二者的濃度變化可以反映肝功能狀況[13]。動物肝臟含有多種酶，當肝臟受損時，會導致血清中酶含量發(fā)生改變，臨床中通過對血清中ALT和AST的檢測判斷肝臟功能[14]。腎功能檢測的指標包括肌酐(Cr)和尿素氮(BUN)[15]。在本試驗對大鼠的肝、腎功能及血糖血脂的檢測結果中，給藥組與空白組相比各項指標均無顯著性差異(P>0.05)，且均在正常生理值范圍內，說明牛蒡子粉對大鼠的血液生化指標無影響。

4.5 對主要臟器的影響 本試驗對大鼠進行大體解剖，仔細觀察給藥組與對照組大鼠主要臟器的大小、顏色、質地，未發(fā)現(xiàn)萎縮、腫脹、充血、淤血、壞死等異常變化，對心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、子宮、睪丸、卵巢等進行稱重，并計算臟/體比值，給藥組與空白組比較無顯著性差異，說明牛蒡子粉對大鼠臟器大體方面無影響。大體解剖未見肉眼可見病變，對高劑量組與空白組部分臟器進行病理組織學檢查，分別對肝、腎、脾、胃腸、睪丸、卵巢等臟器進行HE染色及鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)高劑量組與空白組均有個別大鼠存在部分臟器的輕微病變，但零星分布無規(guī)律性，兩組比較差異不顯著，說明牛蒡子粉對大鼠臟器無病理損害作用。

4.6 結論 牛蒡子粉30 d長期毒性試驗結果表明：對SPF級Wister大鼠以1.5、3及6 g/kg.bw的劑量灌胃給予牛蒡子粉，連續(xù)給藥30 d，各劑量組均無明顯中毒反應及死亡情況；實驗組體增重、進食量及飼料利用率與空白組相比差異不顯著(P>0.05)；實驗組血常規(guī)及血液生化指標、主要臟器臟/體比值與空白組比較差異均不顯著(P>0.05)；對高劑量組與空白對照組進行組織病理學檢查，兩組均有個別大鼠部分臟器出現(xiàn)輕微病變，且零星散在分布，無規(guī)律性，各組之間差異不顯著，故認為與藥物無關。綜上所述，未發(fā)現(xiàn)牛蒡子粉有明顯毒性作用。