吳冕　孫墨瓏

摘要：采用超聲波輔助乙醇浸提法對核桃楸外果皮的總蒽醌進行提取。在單因素試驗的基礎(chǔ)上，通過響應(yīng)面法，采用Design-Expert 8.0.6軟件對各因素進行回歸擬合，確定最佳提取條件，并對核桃楸外果皮提取物進行抗氧化性研究。響應(yīng)面法得到最佳提取條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù)75%、超聲溫度45 ℃、液料比15∶1、超聲時間45 min;在最優(yōu)提取條件下測得核桃楸外果皮總蒽醌的提取率為3.25 mg/g?？寡趸匝芯拷Y(jié)果表明，外果皮中總蒽醌提取物對羥基自由基、亞硝酸根離子和超氧陰離子均表現(xiàn)出顯著的清除效果;對3種自由基的清除能力強弱順序為：羥基自由基>超氧陰離子>亞硝酸根離子，總蒽醌提取物對3種自由基的清除能力整體強于對照品抗壞血酸，表明核桃楸外果皮總蒽醌提取物具有較強的抗氧化性，是一種良好的天然抗氧化劑。

關(guān)鍵詞：核桃楸外果皮;響應(yīng)面法;總蒽醌;抗氧化

中圖分類號：S792;R285文獻標(biāo)識碼：A文章編號：1006-8023（2019）03-0048-06

Extraction of Total Anthraquinones from Green Peel of

Juglans mandshurica Maxim and Its Antioxidant Activity

WU Mian， SUN Molong*

（College of Science， Northeast Forestry University， Harbin 150040）

Abstract：Total anthraquinones were extracted from green peel of Juglans mandshurica Maxim by ultrasonic with ethanol extraction. On the basis of single factor test and response surface method， regression fitting of each factor was carried out by using Design-Expert 8.0.6 software. The optimum extraction conditions were determined by the response surface method， and the antioxidant activity of the extracts was also studied. The extraction condition was determined： 75% volume fraction of ethanol， the temperature was 45 ℃， the ratio of liquid to material was 15∶1， ultrasonic time was 45 min. Total anthraquinone from green peel of Juglans mandshurica was 3.25 mg g-1. The results of antioxidation study showed that total anthraquinone from green peel of Juglans mandshurica had obvious scavenging effect on hydroxyl radical， nitrite ion and superoxide anion. The order of its ability to scavenge the three kinds of free radical was hydroxyl radical > superoxide anion > nitrite ion. The scavenging ability of anthraquinone on these three free radicals was stronger than that of ascorbic acid. This showed that the anthraquinone had strong antioxidant activity and was a good natural antioxidant.

Keywords：Green peel of Juglans mandshurica Maxim; response surface methodology; total anthraquinone; antioxidant

0引言

核桃楸（Juglans mandshurica Maxim）又名山核桃或胡桃楸，為胡桃科胡桃屬落葉喬木，主要分布于我國東北、華北等地區(qū)，是東北闊葉紅松林的重要伴生樹種，也是重要的藥源植物[1]。核桃楸外果皮中含有單寧、胡桃醌、α-和β-氫化胡桃葉醌等，主要成分還有黃酮類、多酚類和萘醌類物質(zhì)[2-5]，具有殺蟲、抗腫瘤、抗菌和抗氧化等性質(zhì)[6-10]。蒽醌類化合物在植物中可游離存在，也可與糖結(jié)合成蒽苷。游離蒽醌與結(jié)合蒽醌因都含有酚羥基，能與不同的堿形成類鹽物，具有消炎、抗癌及抗病毒等作用[11-13]。目前對核桃楸的研究主要關(guān)于外果皮中主要的化學(xué)成分、胡桃醌及總黃酮含量、乙醇提取物的抑菌和殺蟲活性等方面，但對核桃楸中蒽醌類物質(zhì)的提取及其活性的研究甚少。目前，蒽醌類物質(zhì)主要提取方法有水提法，酸性、堿性有機溶劑提取等[14-15]。因此，對核桃楸中蒽醌類物質(zhì)進行提取，充分開發(fā)核桃楸外果皮的活性成分，對核桃楸資源進行合理利用是十分必要的。筆者采用超聲波輔助法對核桃楸外果皮中的總蒽醌進行提取，確定了最佳提取條件，并且對其進行了抗氧化性研究。

1材料與方法

1.1試驗材料

材料：核桃楸外果皮2017年采于東北林業(yè)大學(xué)實驗林場。試劑：1，8-二羥基蒽醌標(biāo)準(zhǔn)品，中國藥品生物制品檢定所;醋酸鎂等其他試劑均為分析純。儀器：RE-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，KQ3200DE型數(shù)控超聲波清洗器;800型電動離心機;TU-1901型紫外分光光度計。

1.2試驗方法

1.2.1核桃楸外果皮總蒽醌的提取優(yōu)化試驗

（1）1，8-二羥基蒽醌標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

總蒽醌含量測定采用醋酸鎂顯色法[16]。精準(zhǔn)配制1，8-二羥基蒽醌標(biāo)準(zhǔn)溶液0.100 mg/mL，精密移取標(biāo)準(zhǔn)溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL，加入0.5%醋酸鎂-甲醇溶液使之顯色，定容至10 mL容量瓶中，在512 nm波長條件下，采用紫外分光光度法測定吸光度A，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程A=62.441c+0.02（c為標(biāo)準(zhǔn)品溶液的濃度，mg/mL），R2=0.999 4。

（2）單因素試驗及響應(yīng)面優(yōu)化試驗

在乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲時間、超聲溫度和液料比中，先選1個因素作為唯一變量，其他因素不變的條件下，探究4個液料比10∶1、15∶1、20∶1、25∶1，4個乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、70%、80%、90%，4個超聲時間30、40、50、60 min，4個超聲溫度30、40、50、60 ℃對總蒽醌提取率的影響。根據(jù)單因素試驗，核桃楸外果皮中總蒽醌提取的最優(yōu)提取條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù)75%，液料比15∶1，超聲時間45 min，超聲溫度45℃。超聲溫度相較于其他3個因素，對總蒽醌的提取率影響較低。

在單因素試驗的基礎(chǔ)上根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗設(shè)計原理[17-19]，運用Design-Expert軟件，選擇對核桃楸外果皮中總蒽醌提取工藝影響顯著的3個因素即超聲時間、乙醇體積分?jǐn)?shù)和液料比作為設(shè)計對象，同時在控制單一變量的條件下為每個因素設(shè)計3個水平。以總蒽醌提取得率為響應(yīng)值Y，對影響超聲提取核桃楸外果皮總蒽醌的工藝參數(shù)進行優(yōu)化，最后得到最佳提取條件。表1為各試驗設(shè)計因素與水平。

（3）總蒽醌提取及含量測定

總蒽醌提取采用乙醇浸提法[16]。稱取核桃楸外果皮粗粉10 g，加入150 mL的75%乙醇溶液，在超聲波清洗器中以45 ℃超聲震蕩45 min，抽濾保留濾液，減壓蒸餾回收乙醇溶液，得到乙醇提取物濃縮液。往乙醇提取物濃縮液中加入10 mL的20%H2SO4和5 mL的10%FeCl3溶液，在80℃水中水解1 h。靜置冷卻后多次加入氯仿萃取，合并氯仿液，減壓蒸餾，得到總蒽醌提取物浸膏。將浸膏溶于無水甲醇中，定容于50 mL容量瓶中。精密移取4 mL總蒽醌提取物甲醇溶液，減壓蒸餾除去甲醇后，加入0.5%醋酸鎂-甲醇溶液使之顯色，搖勻溶解，定容至50 mL容量瓶中。靜置30 min后在512 nm波長處測其吸光度，將A值帶入線性回歸方程，得到核桃楸外果皮中的總蒽醌含量。

1.2.2核桃楸外果皮總蒽醌的抗氧化性試驗

本研究分別采用水楊酸法、重氮偶合比色法和鄰苯三酚法來測定總蒽醌提取物對羥基自由基（·OH）、亞硝酸根離子（NO3-）和超氧陰離子（O2-）的清除率[10]。選用6～24 μg/mL的5個濃度梯度的總蒽醌提取物溶液，配制同樣5個濃度梯度的苯甲酸溶液和抗壞血酸溶液作為對照品，以蒸餾水為空白對照，分別測定3個自由基在510、538、320 nm處的吸光度An以及空白樣的吸光度A0。以清除率E來衡量核桃楸外果皮中總蒽醌提取物的抗氧化性。清除率的計算公式為[19]：

E=A0-AnA0×100%。 （1）

2結(jié)果與分析

2.1核桃楸外果皮總蒽醌的提取結(jié)果分析

2.1.1核桃楸外果皮總蒽醌提取條件優(yōu)化

以總蒽醌提取率為響應(yīng)值Y，對影響超聲提取核桃楸外果皮總蒽醌的工藝參數(shù)（A為乙醇體積分?jǐn)?shù)，B為超聲時間，C為液料比）進行優(yōu)化，最后得到最佳提取條件，試驗結(jié)果見表2。

采用Design-Expert 8.0.6軟件對各因素進行回歸擬合，得到回歸方程：

Y=-3.12+0.05A+0.02B+0.11C+5.54AB+0.77AC+1.06BC-3.14A2-2.9B2-3.28C2。

根據(jù)回歸方程方差分析，決定系數(shù)R2=0.993 3，變異系數(shù)CV=4.93%，說明該回歸模型的擬合方程與實際情況相符合，且誤差較小，可以反映出各因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系。響應(yīng)面方差分析表明，該模型的P<0.000 1說明該二次方程模型F為極顯著，試驗具有很高的可信性和準(zhǔn)確性。根據(jù)顯著性分析結(jié)果顯示，各種因素之間存在一定的交互作用，模型中一次項C，二次項A2、B2、C2均為差異性極顯著影響因素（P<0.000 1），一次項B，交互項AB為差異性顯著影響因素（P<0.05）。A、B、C這3個因素對提取率的回歸系數(shù)檢驗值F分別為0.30、16.01、123.52，由此推斷出，各因素對總蒽醌提取率的影響大小順序為：液料比（C）>超聲時間（B）>乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）。

2.1.2響應(yīng)面圖的分析

根據(jù)回歸模型繪制出的總蒽醌提取率響應(yīng)面的三維圖（圖1），可直觀顯示出響應(yīng)面的最高點以及因素間的交互作用對響應(yīng)值的影響，即總蒽醌的最佳提取條件。

由圖1可以看出，液料比和乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比和超聲時間、乙醇體積分?jǐn)?shù)和超聲時間對總蒽醌提取率的影響皆為顯著的二次拋物線，任意兩個因素之間也有顯著的交互作用。響應(yīng)面曲面的坡度代表著該因素對總蒽醌提取率影響的強弱程度，響應(yīng)面等高線越圓，說明兩個因素間的交互作用越小[20];響應(yīng)面等高線越接近橢圓，說明兩個因素間的交互作用越大[19]。

由圖1（a）可以看出，乙醇體積分?jǐn)?shù)A和超聲時間B的交互作用對總蒽醌提取率影響較大，乙醇體積分?jǐn)?shù)在75%左右和超聲時間在45 min時左右，出現(xiàn)極值。由圖1（b）可看出，乙醇體積分?jǐn)?shù)A與液料比C的交互作用對總蒽醌提取率影響較大，乙醇體積分?jǐn)?shù)在75%左右和液料比在15∶1左右時，出現(xiàn)極值。由圖1（c）可看出，響應(yīng)面圖較圓，超聲時間B和液料比C的交互作用對總蒽醌提取率影響較小，超聲時間在45 min左右和液料比在15∶1左右時，出現(xiàn)極值。根據(jù)響應(yīng)面的設(shè)計分析，核桃楸外果皮中總蒽醌的較優(yōu)提取條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù)75%，超聲時間45 min，液料比15∶1;在最優(yōu)提取條件下測得核桃楸外果皮總蒽醌的提取率為3.25 mg/g。

2.2核桃楸外果皮總蒽醌提取物抗氧化性結(jié)果分析

通過測定核桃楸外果皮總蒽醌提取物對·OH、NO3-、O2-的清除能力，確定核桃楸外果皮總蒽醌提取物的抗氧化性，為保證實驗更具準(zhǔn)確性，每組實驗進行三組平行實驗，結(jié)果取其平均值，總蒽醌提取物對3種自由基的清除作用通過清除率衡量，見表3。

由表3可知，核桃楸外果皮總蒽醌提取物對·OH羥基自由基、NO3-、O2-的清除率均隨著總蒽醌提取物濃度增大而增大，具有清除作用即抗氧化性。通過與苯甲酸和抗壞血酸進行對照試驗可以看出，在相同濃度下總蒽醌提取物的抗氧化性強于苯甲酸和抗壞血酸，其相對順序為外果皮總蒽醌提取物>抗壞血酸>苯甲酸。

由清除率與總蒽醌提取物溶液濃度之間的關(guān)系，得到3個線性回歸方程為：

y=2.54x+10.95（R2=0.976 4）。

y=1.33x+17.95（R2=0.973 3）。

y=1.73x+10.89（R2=0.980 3）。

半抑制濃度IC50是抗氧化劑的抗氧化清除作用達到50%時的濃度，它的大小與抗氧化劑和提供活性氧的物質(zhì)的性能有關(guān)，在抗氧化試驗中用來表征抗氧化作用的強弱[21]。相同條件下IC50值越小，清除能力即抗氧化性能力越強。由回歸方程可得核桃楸外果皮總蒽醌提取物對·OH的抗氧化IC50值為15.37 μg/mL;對NO3-的抗氧化IC50值為24.10 μg/mL;對O2-的抗氧化IC50值為22.61 μg/mL。

總蒽醌提取物對3種自由基均具有顯著的清除能力，核桃楸外果皮總蒽醌提取物的IC50（NO3-）>IC50（O2-）>IC50（·OH），相同條件下IC50值越小，說明較低濃度便可以達到50%的清除效果，即抗氧化性能更強，故核桃楸外果皮總蒽醌提取物對這3種自由基的抗氧化性順序是：·OH>O2->NO3-。

3結(jié)論

蒽醌類物質(zhì)是各種天然醌類化合物中數(shù)量最多的一種，本研究通過1，8-二羥基蒽醌標(biāo)準(zhǔn)品鑒定證實核桃楸外果皮中含有蒽醌類物質(zhì)，并通過響應(yīng)面法優(yōu)化其提取條件，同時對核桃楸總蒽醌進行了抗氧化活性研究。

蒽醌類物質(zhì)廣泛存在于大黃、蘆薈和決明子等植物當(dāng)中。李培[22]等在單因素的試驗基礎(chǔ)上，設(shè)計正交試驗優(yōu)化蘆薈中蒽醌類化合物的超聲波提取工藝，得到蒽醌提取率為6.41 mg/g。本研究采用乙醇浸提法提取核桃楸外果皮中的總蒽醌，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，通過響應(yīng)面法，采用Design-Expert 8.0.6軟件對各因素進行回歸擬合。由數(shù)據(jù)推斷出各因素對總蒽醌提取率的影響大小順序為：液料比>超聲時間>乙醇體積分?jǐn)?shù)，并確定最優(yōu)提取條件為：乙醇濃度75%、液料比15∶1、超聲溫度45℃、超聲時間45 min。采用紫外-可見分光光度法測定外果皮提取液中總蒽醌的含量，在最優(yōu)提取條件下測得核桃楸外果皮總蒽醌的提取率為3.25 mg/g。

蒽醌類物質(zhì)能夠阻斷自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，具有抗氧化作用。李敏[23]等采用超臨界CO2萃取技術(shù)從何首烏中提取出蒽醌類物質(zhì)，將提取物應(yīng)用于清除·OH的抗氧化活性研究，結(jié)果表明何首烏中的蒽醌對·OH有很好的清除效果。本實驗對總蒽醌提取物進行的抗氧化試驗研究結(jié)果表明，總蒽醌提取物對·OH、NO3-、O2-均有明顯的清除效果，IC50（NO3-）為24.10 μg/mL，IC50（O2-）為22.61 μg/mL，IC50（·OH）為15.37 μg/mL，其對3種自由基的清除能力強弱順序為：·OH>O2->NO3-。總蒽醌提取物對3種自由基的清除能力整體強于抗壞血酸和苯甲酸，在濃度比較低的情況下依然有抗氧化作用，表明核桃楸外果皮總蒽醌提取物具有較強的抗氧化性，是一種良好的天然抗氧化劑，具有很好的開發(fā)和利用價值。

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