譚 靜，林紅強，劉云鶴，王 涵，吳福林，董慶海，趙 瑩，李平亞，劉金平，郝秀華,3

(1.吉林大學藥學院天然藥物研究中心，吉林 長春 130021； 2.吉林大學再生醫(yī)學科學研究所生化研究室，吉林 長春 130021；3.吉林大學藥學院藥物制劑教研室，吉林 長春 130021)

血栓心脈寧片(XXT)為中國藥典(2015年版)收載品種，其處方組成包括丹參、川芎、槐花、人參莖葉總皂苷、毛冬青、水蛭、人工牛黃、人工麝香、冰片和蟾酥等10味中藥，具有芳香開竅、活血散瘀之功效[1-3]，臨床上主要用于腦血栓、冠心病、心絞痛屬血瘀證者[4]。研究表明[3,5-6]，XXT抗血瘀的作用靶點很多，包括下調(diào)F13a1、Car1和Tbxa2r等基因以改善血流狀態(tài)，上調(diào)Keap1、Nrf2、HMOX1、GCLM和NQO1等Nrf2信號通路的蛋白表達以抗血管內(nèi)皮細胞氧化損傷，調(diào)控類固醇激素生物合成、花生四烯酸代謝和脂類代謝等內(nèi)源性代謝物通路以治療血瘀等。目前，XXT的化學成分研究主要集中于指紋圖譜的建立及含量測定等方面[7-8]。2015版藥典分別對XXT中的阿魏酸、蘆丁和丹酚酸B等5種成分進行了含量測定[1]；明磊等[9]運用UPLC-ESI-MS/MS和GC-MS技術從XXT中共鑒定出丹參酮類、人參皂苷類及蟾酥甾二烯類等47種非揮發(fā)性成分和龍腦、異龍腦等36種揮發(fā)性成分。但XXT的藥效物質(zhì)基礎研究稍顯薄弱，許多成分尚未明確。

超高效液相色譜-飛行時間質(zhì)譜 (UPLC-Q-TOF MSE) 聯(lián)用技術以其快速、靈敏、高分辨的優(yōu)勢，不僅適用于多組分快速檢測，還能夠?qū)碗s基質(zhì)中的組分準確定性。UNIFI天然產(chǎn)物分析平臺提供的數(shù)據(jù)庫包括從600多種中藥中發(fā)現(xiàn)的6 000多種化合物信息，該平臺能夠?qū)?shù)據(jù)采集、峰提取、分子式確定、數(shù)據(jù)庫檢索以及生成報告相結合，可對化學成分進行快速、全面地定性分析。目前，已有較多文獻[10-17]報道將UPLC-Q-TOF MS與UNIFI平臺結合用于傳統(tǒng)中藥及復方中藥化學成分鑒定。但尚未見采用該方法對XXT的化學成分進行研究的報道。

本研究擬采用UPLC-Q-TOF MS 結合UNIFI平臺，對該復方制劑開展小分子化學成分(100～1 500 u)的快速、全面分析與鑒定，以全面了解該中藥大品種的化學組成。希望為闡明XXT的藥效物質(zhì)基礎和提升質(zhì)量控制標準提供依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 儀器與裝置

Xevo G2-XS型Q-TOF四極桿飛行時間質(zhì)譜儀、ACQUITY UPLC二元泵和樣品管理器、UNIFI科學信息學系統(tǒng)V1.7：美國Waters公司產(chǎn)品；TGL-16aR型飛鴿超離速離心機：上海安亭科學儀器廠產(chǎn)品；FA-N/JA-N型電子天平：上海民橋精密科學儀器有限公司產(chǎn)品；RE 52CS型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海亞榮生化儀器廠產(chǎn)品。

1.2 材料與試劑

血栓心脈寧片(批號分別為：180103、180404和180605)：吉林華康藥業(yè)股份有限公司產(chǎn)品；甲酸鈉、乙腈：UPLC-MS級，美國Fisher公司產(chǎn)品；亮氨酸-腦啡肽：美國Sigma公司產(chǎn)品；純凈水：購自廣州屈臣氏食品飲料有限公司；膽紅素、齊墩果酸、丹參酮IIA、二氫丹參酮Ⅰ、人參皂苷Rg2、人參皂苷Rd、人參皂苷Rf、人參皂苷Rh2、人參皂苷Rb2、人參皂苷Rb3、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1、蘆丁、槲皮素、腺苷、山柰酚、咖啡酸、脂蟾毒配基、丹參酮Ⅰ、豬去氧膽酸、膽酸、華蟾酥毒基、綠原酸對照品：購自中國藥品生物制品檢定所；染料木素、金絲桃苷和隱丹參酮：購自四川省維克奇生物科技有限公司；丹酚酸B、丹參素、原兒茶酸、原兒茶醛：購自北京普天同創(chuàng)生物科技有限公司。

2 實驗部分

2.1 樣品及對照品溶液的制備

取90片(每批次隨機取30片)血栓心脈寧片，研細，混合均勻，精密稱取5.0 g粉末，加50 mL 70%甲醇，回流提取3次，每次2 h，過濾，合并濾液，減壓濃縮至干，加甲醇溶解并定容至5 mL，過0.22 μm 微孔濾膜，備用。

精密稱取適量丹參酮IIA、人參皂苷Rg2、人參皂苷Rd、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rf、人參皂苷Rh2、人參皂苷Rb2、人參皂苷Rb3、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1、蘆丁、脂蟾毒配基、丹參酮Ⅰ、膽酸、華蟾酥毒基、綠原酸、隱丹參酮和丹酚酸B等對照品，加入適量甲醇，超聲溶解，并定容至10 mL，于4 ℃避光保存，備用。

2.2 色譜條件

ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(100 mm×2.1 mm×1.7 μm)；柱溫30 ℃；樣品管理器溫度15 ℃；進樣體積5 μL；流速0.4 mL/min；流動相：A為0.1%甲酸-水溶液， B為0.1%甲酸-乙腈溶液；梯度洗脫條件：0～2 min(10%B)，2～26 min(10%～90%B)，26～28 min(90%B)，28～28.1 min(90%～10%B)，28.1～30 min(10%B)。

2.3 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源(ESI)，MSEcontinuum模式，正離子及負離子檢測模式；質(zhì)量掃描范圍m/z50～1 500；優(yōu)化的儀器參數(shù)如下：ESI+和ESI-模式下，毛細管電壓3.0 kV，錐孔電壓40 V，錐孔氣流量50 L/h，脫溶劑氮氣流量600 L/h，氬氣流量0.15 mL/min，離子源溫度120 ℃，脫溶劑氣溫度300 ℃，低能通道中碰撞能量設置為6 V，高能通道設置為20～40 V。亮氨酸-腦啡肽m/z556.277 1[M+H]+，m/z554.262 0[M-H]-作為Lock Spray實時校正標準液(100 ng/L)，流速15 μL/min，以甲酸鈉溶液對質(zhì)量數(shù)進行校正。

2.4 數(shù)據(jù)處理

首先，通過查閱文獻匯總文獻中的化合物結構式，建立XXT數(shù)據(jù)庫，作為UNIFI分析平臺自帶數(shù)據(jù)庫的補充，并將自建數(shù)據(jù)庫導入分析方法；第二，將LC-MS原始數(shù)據(jù)以Waters Compression and Archival Tool v1.10軟件進行壓縮；第三，通過UNIFI處理平臺對數(shù)據(jù)進行自動篩查與鑒定；第四，篩選質(zhì)量誤差為±5 mu，且響應值大于3 000的成分；最后，根據(jù)碎片離子精確質(zhì)量數(shù)、相對保留時間和分子式、元素分析、離線及在線質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(PubMed、Chemspider、Mass Bank、METLIN)、對照品比對以及查閱相關文獻，對各主要化合物進行人工識別和鑒定。

3 結果與討論

MSE數(shù)據(jù)采集模式可同時進行母離子、子離子、中性缺失分析，通過快速切換低碰撞能和高碰撞能掃描，同時完成兩種掃描功能的數(shù)據(jù)采集，排除假陽性結果。低碰撞能掃描可得到相關分子離子峰及加合離子峰信息；高碰撞能掃描可得到相關碎片峰信息[18]，可為定性分析提供較多的結構信息，實現(xiàn)一次性快速分析多個復雜成分。

本實驗以指紋圖譜共有峰的個數(shù)及強度為指標，考察了 30%、70%、100%甲醇作為提取劑對樣品的提取效果[19]。結果表明，70%甲醇提取物中色譜峰最多，峰強度較大，表明其對各類型成分均具有較好的提取效果，故選擇70%甲醇為提取溶劑。

本研究共鑒定了187種化學成分，包括三萜皂苷、菲醌、蟾蜍甾二烯類、甾體及其他結構類型的化合物。其中，人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg2、人參皂苷Rd等33種成分是通過比對對照品的保留時間、一級質(zhì)譜及二級質(zhì)譜中碎片離子信息進行鑒定。其余成分是通過精確分子質(zhì)量，并結合文獻報道的特征質(zhì)譜信息進行鑒定。正、負離子模式下的基峰離子流圖示于圖1。各保留時間、分子、準分子離子峰實測值及理論值、質(zhì)量誤差、主要碎片離子和來源信息列于附表1，其結構示于附圖1～9(附表和附圖請登錄《質(zhì)譜學報》官網(wǎng)下載)。

3.1 XXT中三萜皂苷類成分分析

從XXT中共鑒定了46種三萜皂苷類成分。以四環(huán)三萜類化合物90為例，在ESI-模式下，高能通道質(zhì)譜圖和裂解碎片示于圖2a(詳細裂解碎片列于附表1)，其準分子離子峰為m/z1 123.594 0[M+HCOO]-，碎片離子m/z459.354 7是原人參二醇皂苷元的特征離子，主要碎片離子m/z915.532 6是由母離子峰丟失1分子葡萄糖殘基(162 u)產(chǎn)生，繼而丟失1分子阿拉伯糖殘基(132 u)及甲基形成碎片離子m/z765.439 6；m/z621.434 3由母離子脫去1分子阿拉伯糖殘基和2分子葡萄糖殘基產(chǎn)生，繼而丟失1分子葡萄糖殘基形成碎片離子m/z459.354 7，這與文獻[20]報道基本一致。由此推測，化合物90為人參皂苷Rc。

五環(huán)三萜類化合物114的高能質(zhì)譜圖和裂解碎片示于圖2b。準分子離子峰為m/z765.445 6[M-H]-，碎片離子m/z601.387 5是由母離子丟失1分子葡萄糖殘基產(chǎn)生，繼而丟失1分子木糖殘基及甲基形成m/z455.312 2，與文獻[21]報道基本一致，故鑒定化合物114為毛冬青皂苷B1。

圖1 正(a)、負(b)離子模式下，血栓心脈寧片的基峰離子流圖Fig.1 Chromatograms of XXT in ESI+ (a) and ESI- (b) mode

圖2 ESI-模式下，化合物90(a)和化合物114(b)的高能質(zhì)譜圖Fig.2 High-energy mass spectra of compound 90 (a) and compound 114 (b) in ESI- mode

3.2 XXT中菲醌類成分分析

從XXT中鑒定了30種菲醌類化合物，其母核多為鄰菲醌和對菲醌，易失去CHO、CH3、H2O及CO等基團。以化合物161為例，準分子離子峰為m/z297.174 6[M+H]+，在ESI+模式下，高能質(zhì)譜圖和裂解碎片示于圖3。m/z282. 122 9、269.156 8是其特征離子峰，與丹參酮IIA碎片離子特征相似，碎片離子m/z282.122 9、269.156 8和239.110 8分別為母離子丟失CH3、CH2O、C3H6O產(chǎn)生；m/z269.156 8和239.110 8繼而分別丟失1分子C5H10、CH3產(chǎn)生碎片離子m/z199.073 5和225.089 8，這與文獻[22]報道基本一致，據(jù)此可推斷化合物161為隱丹參酮。

3.3 XXT中蟾蜍甾二烯類成分分析

從XXT中鑒定了25種蟾蜍甾二烯類成分，該類成分多羥基，C-17側鏈為Δα β，γ δ-δ內(nèi)酯，質(zhì)譜裂解較易脫去H2O和m/z96、109、123、135、136等含有δ-吡喃環(huán)的碎片，其中δ-吡喃環(huán)較易丟失CO形成δ-呋喃環(huán)。以化合物118為例，準分子離子峰為m/z443.242 5[M+H]+。在ESI+模式下，其高能質(zhì)譜圖和裂解碎片示于圖4。m/z401.215 2是通過酯鍵斷裂丟失C2H3O產(chǎn)生，繼而脫去δ-吡喃環(huán)(96 u)(—C5H3O2)形成m/z287.167 2；母離子脫去CO和H2O產(chǎn)生m/z393.202 7，脫去1分子H2O和側鏈C2H3O2形成m/z365.210 6，m/z261.182 8由母離子丟失含δ-吡喃環(huán)的碎片C9H8O4產(chǎn)生。通過與對照品比對，可推斷化合物118為華蟾酥毒基。

圖3 ESI+模式下，化合物161的高能質(zhì)譜圖Fig.3 High-energy mass spectrum of compound 161 in ESI+ mode

3.4 XXT中甾體類成分分析

鑒定了18種甾體類成分，均以環(huán)戊烷駢多氫菲為母核，較易脫去C-3位羥基和C-17位側鏈和羧基。以化合物121為例，其保留時間為12.47 min，準分子離子峰為m/z407.281 2[M-H]-，m/z327.251 3是其特征離子峰。在ESI-模式下，其高能通道質(zhì)譜圖示于圖5。質(zhì)譜圖中出現(xiàn)了碎片離子m/z353.247 7[M-H-3H2O]-、m/z343.264 0[M-H-H2O-HCOOH]-、m/z327.251 3[M-H-2H2O-HCOOH]-、m/z289.217 5[M-H-2H2O-C5H9O2]-，這與對照品的保留時間、碎片離子信息基本一致，結合文獻[23]鑒定化合物121為膽酸。

3.5 XXT中其他類成分分析

應用提取離子色譜法結合UNIFI平臺，共推斷出68種其他類化合物，包括苯丙酸、黃酮、生物堿及內(nèi)酯類等成分。各化合物準分子離子峰的精確質(zhì)量數(shù)均在±5 mu誤差范圍內(nèi)，具體質(zhì)譜數(shù)據(jù)列于附表1。以化合物40為例，其保留時間為6.96 min，準分子離子峰為m/z717.147 3[M-H]-。在ESI-模式下，其高能質(zhì)譜圖和裂解碎片示于圖6。m/z519.092 9是其特征離子峰，由母離子丟失C9H9O5產(chǎn)生，m/z519.092 9繼而丟失1分子羧基形成碎片離子m/z473.086 0；m/z519.092 9斷裂酯鍵分別丟失C9H9O4、C9H9O5產(chǎn)生m/z339.050 5、321.040 0，m/z321.040 0繼而丟失CO產(chǎn)生m/z293.045 0，這與對照品的保留時間及碎片離子信息基本一致，結合文獻[24]推斷化合物40為丹酚酸B。

圖4 ESI+模式下，化合物118的高能質(zhì)譜圖Fig.4 High-energy mass spectrum of compound 118 in ESI+ mode

圖5 ESI-模式下，化合物121的高能質(zhì)譜圖Fig.5 High-energy mass spectrum of compound 121 in ESI- mode

圖6 ESI-模式下，化合物40的高能質(zhì)譜圖Fig.6 High-energy mass spectrum of compound 40 in ESI- mode

4 結論

本研究將UPLC-Q-TOF MS與UNIFI天然產(chǎn)物分析平臺相結合，用于分析血栓心脈寧片化學成分。通過比對各成分對照品的精確分子質(zhì)量、保留時間及質(zhì)譜碎片離子信息，并借助文獻報道，從XXT中共鑒定了三萜皂苷、菲醌、蟾蜍甾二烯及甾體等多種結構類型共187種化學成分。結果表明，該復方制劑中化學成分豐富、結構多樣，為全面了解血栓心脈寧片的化學組成提供了數(shù)據(jù)支持，同時，化學成分的結構多樣性可為闡明其作用靶點多樣性奠定物質(zhì)基礎。由于對照品和文獻報道有限，仍有一些未鑒定的成分，在后續(xù)工作中有待進一步分離與鑒定，同時對各成分與各作用靶點進行關聯(lián)性研究。