周天水， 崔榮煜， 史紫千， 馮 芳

（蘇州科技大學 化學生物與材料工程學院，江蘇 蘇州 215009；江蘇省環(huán)境功能材料重點實驗室，江蘇 蘇州 215009）

近年來，可生物降解聚合物被不斷地應用到制備微球制劑中，其中聚酯類高分子材料作為載體材料包裹蛋白、多肽等藥物來進行控制釋放研究，尤其是聚乳酸-羥基乙酸共聚物材料被研究得最多。聚乳酸-羥基乙酸共聚物（poly（lactic-co-glycolic acid），PLGA）是由乳酸和羥基乙酸按比例共聚形成的高分子材料，具有良好的生物相容性、無毒性及可生物降解性[1]，該材料被美國FDA 批準應用于臨床。聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA）包載蛋白、多肽等藥物制成緩釋藥物微球可以解決口服藥易降解、減少給藥次數(shù)等問題[2]，其降解產(chǎn)物為H2O 和CO2[3-5]，對蛋白類無明顯影響。由于蛋白、多肽等分子藥物穩(wěn)定性差，在負載過程中易流失，因此，筆者首次采用同軸電噴法實現(xiàn)羥乙基殼聚糖和透明質(zhì)酸形成的凝膠溶液為蛋白、多肽類藥物提供親水環(huán)境，從而有利于保持藥物活性，避免藥物大量流失。相比較其他微球制備方法，同軸電噴法[6-7]一步到位實現(xiàn)微球制備及包載藥物，并且具有單分散性、可重復性、微球尺寸可控性等優(yōu)勢，在藥物控釋領(lǐng)域具有較高的應用前景。以往微球制備研究多集中在乳化法制備工藝對微球形態(tài)的影響，而對于使用電噴法來制備核殼結(jié)構(gòu)的凝膠內(nèi)核微球的制備工藝的綜合研究較少。

筆者以牛血清蛋白（BSA）為模擬蛋白，PLGA材料為模擬蛋白載體，采用同軸電噴法來制備BSA-PLGA微球，研究了四種電噴參數(shù)對微球形貌及粒徑的影響，驗證了使用羥乙基殼聚糖和透明質(zhì)酸形成的凝膠溶液穩(wěn)定BSA 制備出PLGA 微球的形貌良好，粒徑較均一，激光共聚焦掃描顯微鏡表征了微球的核殼結(jié)構(gòu)。

1 實驗部分

1.1 主要試劑及儀器

聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA），山東省醫(yī)療器械研究所；牛血清白蛋白（BSA），南京生興生物科技有限公司；二氯甲烷（DCM），分析純，蘇州華麗達精細化工有限公司；透明質(zhì)酸鈉（HA），阿拉丁試劑有限公司；羥乙基殼聚糖，分析純，阿拉丁試劑有限公司；蒸餾水，自制。

場發(fā)射掃描電子顯微鏡，S-4800，QUANTAFEG，日本日立公司；微量注射泵，TJ-3A/LSP01-1A，保定蘭格恒流泵有限公司；激光共聚焦掃描顯微鏡，OLYMPUS，徠卡顯微系統(tǒng)（上海）貿(mào)易有限公公司；電噴裝置，四個部分，自組。

1.2 載BSA的PLGA微球制備

稱取一定量的PLGA 溶解到二氯甲烷溶劑中，通過磁力攪拌使其完全溶解，配置的PLGA 溶液作為殼層溶液；稱取一定量的透明質(zhì)酸、羥乙基殼聚糖、牛血清蛋白，將其完全溶于蒸餾水中，作為核層溶液。用注射器分別將核層、殼層溶液吸入其中，接入同軸金屬針管，再施加一定的電壓，調(diào)整接收距離、流速比等，在接收載臺的鋁箔紙上接收微球，冷凍干燥后得到PLGA 載BSA 微球，密封冷凍保存。制備過程中使用同軸電噴霧法把PLGA 溶液和BSA 凝膠液分別通入注射器，注射器與噴頭連接，同軸噴射頭由內(nèi)外層管道形成同心圓柱。在一定電壓下，同軸針管口與接收載臺處形成電場力，針管口處可以觀測到形成錐射流即Taylor 錐。

1.3 制備條件對PLGA微球的影響

同軸電噴制備過程中，以羥乙基殼聚糖和透明質(zhì)酸鈉形成的凝膠作為內(nèi)核材料，PLGA 作為外殼材料進行同軸電噴，考察電噴電壓、殼層溶液濃度、進樣速度和凝膠內(nèi)核溶液濃度等參數(shù)對PLGA 微球形貌、粒徑及分布的影響。采用單因素分析，研究高分子溶液濃度、電壓、推進速度、接收距離對微球表面形態(tài)的影響，從而優(yōu)化出制備微球的最佳條件。制備條件如下：以二氯甲烷為溶劑，殼流速為2 mL·h-1，電壓為10 kV，接收距離為15 cm，改變PLGA 溶液濃度進行考察微球形貌。固定PLGA 濃度為10%，殼流速為2 mL·h-1，接收距離為15 cm，改變電壓進行考察微球形貌。固定PLGA 濃度為10%，電壓為10 kV，接收距離為15 cm，改變?nèi)芤簹恿魉倏疾煳⑶蛐蚊?。固定PLGA 濃度為10%，電壓為10 kV，殼流速為2 mL·h-1，改變接收距離來考察微球形貌。實驗中PLGA 溶液濃度為質(zhì)量體積比。

1.4 SEM測試與粒徑統(tǒng)計

把收集載臺上的微球樣品噴金置于S4800 掃描電鏡下觀察其形貌。并用Image-pro Plus 軟件分析電鏡圖片，統(tǒng)計平均粒徑。

1.5 激光共聚焦測試

使用激光掃描共聚焦顯微鏡來掃描微球。

2 結(jié)果與分析

2.1 電噴溶液濃度對微球形貌、粒徑及分布的影響

不同PLGA 電噴溶液濃度下的SEM圖如圖1 所示。

在電噴實驗中，當PLGA 濃度在8%以下時，得不到完整的顆粒。當PLGA 溶液濃度為8%～10%時，可以看出微球顆粒表面趨于光滑， 顆粒與顆粒之間存在少量粘連纖維。當溶液濃度達到10%～12%和12%～14%時，顆粒由圓形逐步變成橢圓形并且顆粒間粘連很多，有研究提及PLGA 濃度過大后容易出現(xiàn)串珠結(jié)構(gòu)[8]。濃度為12%時，電場力克服表面張力形成射流，產(chǎn)生了形如啞鈴形狀射流，兩個大液滴連在一條細射流上， 且隨著聚合物濃度進一步加大，粘滯力也隨之增大，顆粒越發(fā)不成球形態(tài)，啞鈴形逐漸向纖維形狀轉(zhuǎn)變。對PLGA 溶液濃度為6%、8%、10%時進行微球直徑及分布統(tǒng)計，詳見圖2。隨著PLGA 濃度的增大，顆粒由橢球形逐步變成紡絲狀，粘度升高，表面張力無法降低其粘性，無法形成球形而呈現(xiàn)出紡絲形態(tài)。不同PLGA 濃度下的粒徑分布如圖2所示。由圖2 可知，當PLGA 溶液濃度為10%時，顆粒表面趨于正圓形，制得的PLGA 微球形貌及變化趨勢與Xie 等人[8]研究結(jié)果相似，所以筆者選用10%的PLGA 溶液來制備顆粒，顆粒表面光滑，呈現(xiàn)良好的分散性，適合制備微球。

圖2 不同PLGA 濃度下制備微球的粒徑分布

2.2 負載電壓對微球形貌、粒徑及分布的影響

不同電壓下制備微球的SEM圖如圖3 所示。

圖3 不同電壓下制備微球的SEM圖

圖3 中的不同電壓下微球之間存在一些連接細纖維，主要還是由于剛剛噴射時，噴頭處射流不穩(wěn)定以及在接收臺左側(cè)鐵質(zhì)儀器對其有一定的牽引力，但是從圖中可以看出基本呈現(xiàn)微球形態(tài)。在8、9 kV 時，針頭處射流不穩(wěn)定，微球少些呈現(xiàn)橢圓形且有一些粘連。在12 kV 左右時，微粒間纖維連接過大，微粒大部分呈現(xiàn)橢圓形，可能電壓過大導致了射流不穩(wěn)定，無法形成均一的微球。隨著電壓增大，微球粒徑基本呈現(xiàn)出變大趨勢，粒徑分布很集中。隨著電壓的增加，顆粒粒徑逐步減小，粒徑與電壓呈負相關(guān)，電壓從8 kV 增加到12 kV，電壓增加，粒徑減小，這與Tang 等人[9]研究結(jié)果基本一致。

從圖4 不同電壓粒徑結(jié)果中可以看到，隨著電壓的不斷升高，聚合物微球粒徑呈現(xiàn)變大趨勢，當電壓達到一個上限時，分裂出的射流數(shù)量增多，微球粒徑有些減小。在8 kV 電壓及以下，電場力不足以克服液滴表面張力，噴射出的大都是大液滴形狀，不能形成微球形態(tài)。在電壓大于12 kV 后，可以看出由于電壓過大產(chǎn)生多股射流并且造成的噴射流不穩(wěn)定。由此文中將選定10 kV 電壓來制備PLGA 微球。

2.3 溶液進樣速度對微球形貌、粒徑及分布的影響

不同進樣流速下制備微球的SEM圖如圖5 所示。

殼層溶液的進樣速度從1 mL·h-1開始，當流速為1 mL·h-1時，從圖5 中可以看出，已開始電噴出微球顆粒，但是大多數(shù)不能呈現(xiàn)球態(tài)而是纖維絲狀， 當流速從1.5 mL·h-1增大到2.5 mL·h-1時，可以從圖中看出，隨著流速不斷增大，產(chǎn)生的微球顆粒的粒徑也呈現(xiàn)增大趨勢，在2 mL·h-1時流速下，電噴產(chǎn)生的微球形貌良好，微球表面光滑。當流速增大到3 mL·h-1時，從圖5e 中可以看到，微球粒徑變小，由于電噴過程中，流速已經(jīng)超過了最大極限流速，導致顆粒由球形向橢球形轉(zhuǎn)變，且微球顆粒之間的粘連也不斷增大。

圖4 不同負載電壓下制備微球的粒徑分布

圖6 也明顯反映出微球粒徑隨著流速的變化趨勢。研究發(fā)現(xiàn)隨著殼層流速的增大，微球粒徑也隨之增大，該變化趨勢與Xu 等人[10]研究相同，但是發(fā)現(xiàn)微球當流速達到極限值時，出現(xiàn)了拐點，在3 mL·h-1時，粒徑變小，微球顆粒已不能呈現(xiàn)良好的球行。所以文中選定殼層流速2 mL·h-1為最佳流速。

2.4 接收距離對微球形貌的影響

接收距離對微球形貌的影響如圖7 所示。

接收距離在13 cm 以下并不能制備出微球。從圖7 中可見，隨著接收距離不斷增大，從13 cm 開始微球的形貌發(fā)生很大變化，從一開始的橢圓形向球形轉(zhuǎn)變，當接收距離從16 cm到17 cm 的變化中可以看出，已經(jīng)基本不能夠制備出微球，基本呈現(xiàn)紡絲狀，超出了最佳的接收距離范圍，從17 cm 往后只能電噴得到紡絲狀，由此文中選擇15 cm 為最佳的接收距離。

圖6 不同進樣流速下制備微球的粒徑分布

圖7 不同接收距離下制備微球的SEM圖

2.5 優(yōu)化條件下制備的微球形貌

優(yōu)化條件下制備的微球形貌如圖8 所示。

在最佳的優(yōu)化條件： 殼流速為2 mL·h-1，PLGA 濃度為10%，電壓為10 kV，接收距離為15 cm 等條件下制備出如圖所示的PLGA 微球。由圖8 可見，在這樣的條件下制備出的微球比較分散，基本呈球形，表面光滑。

圖8 優(yōu)化條件下制備BSA-PLGA 微球在不同放大倍數(shù)下的電鏡形貌圖

2.6 共聚焦顯微鏡下的微球形貌

共聚焦顯微鏡下的微球形貌如圖9 所示。

通過在凝膠內(nèi)核溶液中加入牛血清蛋白（BSA），并使用優(yōu)化條件來制備出BSA-PLGA 微球，其中牛血清蛋白（BSA）的濃度為5%，分別在激發(fā)波長下和白光下對BSA-PLGA 微球進行激光共聚焦的表征。從圖9a 可知，能夠看到分散的內(nèi)核光點， 這是由于牛血清蛋白具有熒光性，可以發(fā)出綠光，在圖中呈現(xiàn)光亮內(nèi)核。通過圖9a 熒光圖和圖9b 白光圖的對比， 載藥微球已完全包裹住牛血清蛋白， 并且從圖9a 和圖9b 中看出，殼層已經(jīng)完整覆蓋內(nèi)部，形成圓環(huán)，表明制備出了核殼結(jié)構(gòu)微球。

圖9 優(yōu)化條件下BSA-PLGA 微球的共聚焦顯微鏡圖

3 結(jié)語

（1）通過同軸電噴霧法制備出BSA-PLGA 微球。通過對聚合物濃度、殼層流速、負載電壓、接收距離等參數(shù)的優(yōu)化實驗，得到最佳的優(yōu)化條件：PLGA 濃度為10%，殼流速為2 mL·h-1，負載電壓為10 kV，接收距離為15 cm。（2）通過優(yōu)化條件下制備BSA-PLGA 微球電鏡圖以及共聚焦顯微鏡圖可以看到，制備出的微球粒徑比較均勻，表面光滑，包裹的BSA 蛋白比較完整，沒有出現(xiàn)結(jié)構(gòu)破損現(xiàn)象。